Bookshelf

Zidentyfikowano wiele enzymów zaangażowanych w biogenezę peptydów

Najczęstsze etapy przetwarzania prekursorów i zaangażowane w nie enzymy przedstawiono na rycinie 18-5. Zaangażowane endoproteazy to konwertaza prohormonu 1 i 2 (PC1 i PC2), egzopeptydaza to karboksypeptydaza E (CPE, zwana również CPH i konwertazą enkefaliny), a enzym α-amidujący to monooksygenaza α-amidująca peptydyloglicyny (PAM). Wiele etapów ich biosyntezy nie jest unikalnych dla neuropeptydów, takich jak rozszczepienie peptydu sygnałowego, tworzenie wiązań disulfidowych, dodanie i późniejsza modyfikacja N- i O-liniowych oligosacharydów, fosforylacja i sulfacja. Jak pokazano na rycinie 18-3, wiele etapów potranslacyjnych zachodzi, gdy dojrzewające neuropeptydy przemieszczają się w dół aksonu w kierunku synapsy w LDCV. Późniejsze etapy biosyntezy neuropeptydów (Ryc. 18-5) są unikalne dla neuronów i komórek endokrynnych.

Kluczowe enzymy w biosyntezie neuropeptydów obejmują endoproteazy, egzoproteazy i enzymy modyfikujące końce peptydów. Odkrycie i charakterystyka Kex2p, endoproteazy, która rozszczepia drożdżowy czynnik kojarzenia pro-α w celu wytworzenia czterech kopii feromonowego czynnika kojarzenia α (ryc. 18-2), były kluczowe dla odkrycia prohormonalnych konwertaz ssaków, w tym furiny, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC i PACE4 . Konwertazy prohormonalne wykazują homologię z subtilzynami bakteryjnymi i posiadają triadę katalityczną Asp-His-Ser, która składa się z trzech kluczowych aminokwasów biorących udział w katalizie (oznaczonych D, H i S na ryc. 18-5). Proregion każdego z nich (Rys. 18-5) musi być obecny podczas biosyntezy, aby proteaza mogła się prawidłowo złożyć, ale musi zostać usunięty, aby otrzymać aktywowaną proteazę. W przypadku PC1 i furiny, usunięcie proregionu następuje w ciągu kilku minut biosyntezy, gdy enzym znajduje się w retikulum endoplazmatycznym i jest najprawdopodobniej procesem autokatalitycznym. W przypadku pozostałych konwertaz prohormonalnych usuwanie proregionu jest znacznie wolniejsze. Ekspresja aktywnej PC2 wymaga koekspresji peptydu 7B2 (Ryc. 18-5), który wydaje się pełnić funkcję chaperonu i może również zapobiegać ekspresji aktywności endoproteolitycznej PC2 do czasu, gdy PC2 zostanie zdeponowana w ziarnistościach wydzielniczych. Dla innych konwertaz prohormonalnych nie zidentyfikowano odpowiedniego peptydu chaperonowego/inhibitorowego.

Endoproteazami ssaków najwyraźniej zaangażowanymi w przetwarzanie neuropeptydów są PC1 i PC2, zależne od Ca2+ proteazy znajdujące się w ziarnistościach wydzielniczych, których ekspresja jest ograniczona do neuronów i komórek endokrynnych (ryc. 18-5). Kilka innych członków tej rodziny endoproteaz wykazuje szerszą ekspresję, podczas gdy jeszcze inne ulegają ekspresji w ograniczonych lokalizacjach, odmiennych od neuronów i komórek endokrynnych. Na przykład, furyna występuje praktycznie we wszystkich komórkach i jest zlokalizowana głównie w sieci trans-Golgiego; furyna katalizuje rozszczepienia ważne dla funkcji peptydów, takie jak początkowe rozszczepienie prekursorów ELH, czynnika wzrostu nerwów i hormonu przytarczyc, jak również rozszczepienie w obrębie prekursora receptora insuliny w celu wytworzenia aktywnej formy dimeru αβ receptora. Furina może być również pomocna w aktywacji niektórych innych enzymów przetwarzających, takich jak PC2 i CPE.

PC1 i PC2 rozszczepiają się na wybranych parach aminokwasów zasadowych w prekursorach peptydowych: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys i Arg-Lys. PC1 może również katalizować rozszczepienia przy wybranych pojedynczych miejscach Arg obecnych w niektórych prekursorach, takich jak prozomatostatyna i procholecystokinina. Rozszczepienia w LDCV przez PCs są ściśle kontrolowane, często zachodzą w bardzo uporządkowany sposób (ryc. 18-6). Początkowe rozszczepienia POMC zachodzą w czasie krótszym niż 1 godzina (ryc. 18-6, etapy 1 i 2), podczas gdy inne rozszczepienia pojawiają się dopiero po kilku godzinach (ryc. 18-6, etapy 6 i 7). Rozszczepienie endoproteolityczne propeptydów jest często reakcją ograniczającą szybkość przetwarzania biosyntetycznego peptydów.

Wzór rozszczepień katalizowanych przez PC1, PC2 i furynę, gdy ulegają ekspresji w neuronach i komórkach endokrynnych, jest znacznie bardziej selektywny niż wzór rozszczepień widoczny w próbach probówkowych z oczyszczonymi enzymami. Na przykład, chociaż konwertazy prohormonalne zwykle rozszczepiają się na COOH-końcu pary reszt podstawowych w modelowych substratach peptydowych, w komórkach rozszczepienie może nastąpić w środku pary reszt podstawowych, jak w przypadku rozszczepienia POMC (ryc. 18-6), gdzie reszty podstawowe są rozdzielone i pozostają z dwoma powstałymi dojrzałymi peptydami. Prawdopodobnie stężenie Ca2+ i wewnętrzne pH LDCVs to dwie zmienne wykorzystywane przez neurony i komórki endokrynne do regulacji aktywności endoproteolitycznej w LDCVs.

Można wykazać, że dodatkowe endoproteazy odgrywają rolę w biosyntezie neuropeptydów. Głównymi kandydatami są ssaki, będące homologiem drożdżowej proteazy aspartylowej-3 (YAP-3) oraz N-argininine dibasic (NRD) convertase. Dodatkowy zwrot w biosyntezie peptydów obserwuje się w sercu, gdzie proatrialny czynnik natriuretyczny (proANF) jest magazynowany w LDCVs, a jednocześnie dojrzały ANF jest uwalniany z komórek przedsionków do krążenia. W proces przetwarzania proANF, który obejmuje rozszczepienie po pojedynczej reszcie Arg w proANF, nie mogą być zaangażowane PC1 lub PC2, ponieważ w sercu występują znikome ilości tych PC.

CPE jest rozpuszczalnym białkiem występującym praktycznie we wszystkich LDCV w neuronach i komórkach endokrynnych (ryc. 18-5) . Usuwa ono reszty zasadowe, Lys lub Arg, z końców COOH intermediatów peptydowych wytwarzanych przez konwertazy prohormonów. Został on pierwotnie zidentyfikowany dzięki swojemu rozmieszczeniu w tkankach i specyficzności substratowej oraz specyficznemu hamowaniu przez kwas guanidynoetylomerkaptobursztynowy (GEMSA). CPE jest enzymem aktywowanym przez Co2+- i Zn2+ z krótkim proregionem, który jest normalnie usuwany podczas dojrzewania enzymu; w przeciwieństwie do konwertaz prohormonalnych, CPE jest aktywna z dołączonym proregionem. Funkcja karboksypeptydaz w przetwarzaniu peptydów nie jest zwykle ograniczająca tempo, ponieważ intermediaty peptydowe z COOH-końcowymi resztami podstawowymi są wykrywane tylko w bardzo niskich stężeniach w tkankach lub ekstraktach LDCV. Ostatnio zidentyfikowano dodatkowe karboksypeptydazy, zwłaszcza CPD, integraln± błonow± formę enzymu z 3 domenami karboksypeptydazowymi. Względne znaczenie CPE i tych dodatkowych karboksypeptydaz dla przetwarzania neuropeptydów in vivo jest niejasne. Biorąc pod uwagę, że rozszczepienie przy parze reszt zasadowych może być w środku pary, istnieją dobre powody, aby sądzić, że aminopeptydaza zostanie znaleziona w LDCVs.

PAM jest dwufunkcyjnym enzymem znalezionym w prawie wszystkich LDCVs (ryc. 18-5) . PAM działa na substraty peptydowe po rozszczepieniu endoproteolitycznym i działaniu egzopeptydaz, gdy odsłonięta jest COOH-końcowa reszta Gly, i przekształca peptydylo-Gly w odpowiadający im peptyd-NH2. Około połowa znanych bioaktywnych peptydów jest α-amidowana, a α-amidacja ma zasadnicze znaczenie dla biologicznej siły działania. Formy peptydylo-Gly i peptyd-COOH są zazwyczaj nieaktywne w stężeniach fizjologicznych. Pierwszy etap reakcji α-amidacji jest wykonywany przez monooksygenazę α-hydroksylującą peptydyloglicynę (PHM), która jest NH2-końcową częścią dwufunkcyjnego białka PAM. PHM wi±że dwa atomy Cu2+ , które uczestnicz± w katalizie, przechodz±c cykle redukcji i utleniania. PHM wykorzystuje kwas askorbinowy jako reduktant, przy czym jeden atom tlenu z O2 jest wbudowywany do peptydu podczas etapu hydroksylacji. Tak więc PHM jest enzymatycznie bardzo podobna do β-mono-oksygenazy dopaminowej (DBM), która przekształca dopaminę w noradrenalinę (patrz rozdz. 12). Drugi etap reakcji α-amidacji jest wykonywany przez drugą domenę enzymatyczną PAM, liazę α-amidującą peptydylo-α-hydroksyglicynę (PAL). Domena PAL stanowi nowy, zależny od jonów metali dwuwartościowych enzym. Neurony wykazują głównie ekspresję integralnej formy błonowej dwufunkcyjnego białka PAM (ryc. 18-5), podczas gdy dodatkowe zdarzenie polegające na rozszczepieniu mRNA umożliwia niektórym komórkom endokrynnym ekspresję rozpuszczalnych wersji białka, pozbawionych domeny transmembranowej. W integralnych formach błonowych PAM, krótka COOH-końcowa domena rozciąga się do cytoplazmy i uczestniczy w kierowaniu PAM pomiędzy LDCV a powierzchnią komórki. Podaż zredukowanego askorbinianu w LDCVs jest utrzymywana przez cytochrom B561, białko posiadaj±ce pięć domen transmembranowych, które przenosi elektrony z cytozolowego askorbinianu do askorbinianu w ¶wiatle LDCVs. Cytochrom B561 znajduje się również w pęcherzykach zawierających katecholaminę, gdzie pełni podobną funkcję dla DBM (patrz rozdz. 12). Tkanki nerwowe i endokrynne utrzymują stężenia zredukowanego askorbinianu około 100-krotnie wyższe od stężenia askorbinianu we krwi, podczas gdy większość innych tkanek nie koncentruje askorbinianu.

Kilka peptydów ma NH2-końcowe reszty kwasu piroglutaminowego, określane również jako cykliczny kwas glutaminowy (<Glu), które są niezbędne do bioaktywności, na przykład hormon uwalniający tyreotropinę (TRH) i hormon uwalniający gonadotropiny (GnRH). Enzymem odpowiedzialnym za ten etap jest cyklaza glutaminylowa, która przekształca pierwotną NH2-końcową Gln w <Glu. Regulacja i funkcja cyklazy glutaminylowej nie została jeszcze dokładnie poznana. Inną ważną, ale rzadko spotykaną modyfikacją peptydów jest α-N-acetylacja (ryc. 18-6 i 18-7). W trakcie przetwarzania POMC, α-N-acetylacja znacznie zwiększa przyciemniającą skórę siłę ACTH(1-13)NH2, jednocześnie znosząc zarówno steroidogenną siłę ACTH, jak i opiatową aktywność β-endorfiny. Enzym(y) odpowiedzialny za tę modyfikację nie został jeszcze oczyszczony ani sklonowany.

Jako przykład, Rysunek 18-6 przedstawia schemat etapów przetwarzania w systemie POMC . Początkowe etapy endoproteolityczne (ryc. 18-6, etapy 1-4) są mediowane przez PC1 i występują we wszystkich neuronach produkujących POMC i komórkach endokrynnych, zwykle w przedstawionej kolejności numerycznej. Jest oczywiste, że etapy 1 i 2 są inicjowane w sieci trans-Golgiego i kontynuowane w LDCV, podczas gdy etap 4 występuje tylko w LDCV. Kroki 5-7 zachodzą tylko w LDCVs i wydają się wymagać PC2. W dorosłej przedniej części przysadki kortykotropy zawierają PC1, ale nie PC2 i wykonują tylko rozszczepienia 1-4. Jednakże podczas wczesnego rozwoju postnatalnego kortykotropy wykazują ekspresję PC2, a rozszczepienia 5-7 są przejściowo obserwowane w kortykotropach. U szczura, ekspresja PC2 i rozszczepienie w ACTH (rozszczepienie 5) zmniejszają się jednocześnie kilka tygodni po urodzeniu, w czasie, że około, że dorosły wzór kontroli ACTH nad steroidogenezą adrenal.

Melanotropów i neuronów CNS podejmowania POMC wyrazić zarówno PC1 i PC2, a zatem mniejsze produkty peptydowe są postrzegane w tych komórkach. PAM ulega ekspresji we wszystkich komórkach produkujących POMC, więc α-amidacja peptydu łączącego (JP), małego peptydu bez wyraźnej funkcji biologicznej, zachodzi szybko we wszystkich komórkach POMC (ryc. 18-6). W melanotropach przysadki pośredniej oraz w neuronach POMC jądra drogi samotnej dochodzi do α-N-acetylacji ACTH(1-13)NH2 i β-endorfiny. W melanotropach, α-N-acetylacja ACTH może wystąpić przed rozszczepieniem 5. Jak pokazano na rysunku 18-4, poszczególne rozszczepienia i modyfikacje NH2- i COOH-końców produktów peptydowych decydują o mieszaninie uwolnionych bioaktywnych peptydów.

.