Kondensor – różne typy. Kontrast w mikroskopie
W poprzednim artykule na temat okularu, zwróciłem uwagę, że okular jest zwykle umieszczony tak, że jego przednia płaszczyzna ogniskowa jest zbieżna z płaszczyzną obrazu pierwotnego (PIP). PIP jest sprzężona z próbką w obrazowym układzie płaszczyzn sprzężonych i dlatego jest przydatna do pomiaru cech okazów mikroskopowych.
W ten sam sposób, przednia płaszczyzna ogniskowa kondensora jest sprzężona z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu (ale nie z próbką) w oświetleniowym układzie promieni. Kondensor stanowi zatem dostępne miejsce, w którym możemy zmieniać lub regulować kontrast obrazu poprzez manipulowanie promieniami oświetlającymi. Te dwie zasady wynikają z metody oświetlania Köhlera, która została omówiona w części 3 tej serii.
Funkcja kondensora
Kondensor spełnia dwie funkcje w mikroskopie. Zapewnia obszar równomiernie oświetlony w polu widzenia na płaszczyźnie preparatu i równomiernie oświetla aperturę obiektywu światłem o wystarczającym, ale dającym się kontrolować kącie. Po drugie, jak wspomniano powyżej, zapewnia on możliwość regulacji kontrastu (Bradbury & Evennett, 1996). Najprostszą formą kondensora jest lusterko wklęsłe, ale nie jest ono użyteczne dla obiektywów powyżej NA 0,2 lub więcej. Jeśli Twój mikroskop posiada lusterko i zdalne źródło światła, płaska strona lusterka musi być używana w połączeniu z każdym zamontowanym kondensorem podprogowym. Dzieje się tak, ponieważ, ściśle mówiąc, kondensor powinien otrzymać równoległe oświetlenie i w ten sposób doprowadzić to światło do ogniska na tylnej płaszczyźnie ogniskowej kondensora (gdzie znajduje się preparat).
Typy kondensorów
Najczęściej używanym typem kondensora jest kondensor Abbego do mikroskopii jasnego pola (Rysunek 1a, 1b). Jest on zbudowany z dwóch lub trzech soczewek, a górna soczewka krótkoogniskowa może być zwykle odsunięta z toru optycznego (1a) lub odkręcona (1b), aby wypełnić pole widzenia obiektywami o niskiej mocy. Ten prosty oświetlacz jest wystarczający do większości typów mikroskopii. Został on pierwotnie zaprojektowany do dostarczania wąskich wiązek (lub „ołówków”) skośnego światła z mimośrodowo umieszczonego otworu w przedniej płaszczyźnie ogniskowej kondensora. Rysunek 1c przedstawia prosty dwusoczewkowy iluminator Abbego zamontowany na aparacie podstopniowym, który mógł być obracany i przemieszczany mimośrodowo w celu zapewnienia skośnego oświetlenia. Rysunek 1d przedstawia kondensor małej mocy zaprojektowany do całkowitego wypełnienia dużego pola widzenia obiektywów o bardzo niskim powiększeniu.
Chociaż apertura numeryczna może być podawana dla kondensora (często 0,9 NA dla kondensorów suchych i maksymalnie 1,4 NA dla typów olejowych), liczby te nie dają wskazówek co do NA, dla której promienie oświetlające są korygowane ze względu na aberrację sferyczną. W wielu prostych kondensorach stały stożek światła dla oświetlenia osiowego rzadko jest korygowany pod kątem aberracji sferycznej powyżej 0,45 NA. W przypadku pracy wysokiej jakości oraz przy rozdzielaniu struktur na granicy rozdzielczości, kondensory muszą być skorygowane pod względem aberracji. W pełni skorygowane kondensory, podobnie jak obiektywy, zawierają wiele elementów soczewek i mogą być korygowane prawie w tym samym stopniu. Kondensor achromatyczno-aplanatyczny (1e) jest skorygowany zarówno na aberrację sferyczną jak i chromatyczną i powinien być używany do prac najwyższej jakości oraz do kolorowej fotomikrografii. Kondensory aplanatyczne są korygowane tylko dla aberracji sferycznej.
Tzw. kondensory „uniwersalne” (rys. 2) są wielofunkcyjne. Składają się one z obrotowego dysku, na którym znajdują się wybrane diafragmy aperturowe, filtry, ograniczniki, płytki fazowe lub pryzmaty Wollastona do różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC). Taki układ pozwala na wygodną i łatwą zmianę z jednej metody kontrastowej na drugą. Ogranicznik ciemnego tła działa tylko do NA 0,5 lub mniej. Do użycia z obiektywami o wyższych wartościach NA należy użyć specjalnie skonstruowanego kondensora ciemnego tła (Rysunek 3). Szczegóły dotyczące jego użycia, a także innych metod zwiększania kontrastu, patrz Bradbury & Evennett (1996).
Rysunek 2. Kondensatory uniwersalne. Centralny obraz przedstawia zdjętą górną pokrywę, ukazując obracającą się tarczę, w której znajdują się aperturowe pierścienie fazowe, pryzmaty DIC, ograniczniki ciemnego tła, dyski Rheinberga i filtry modulacyjne Hoffmana. Większość kondensorów uniwersalnych posiada przysłonę aperturową do pracy w jasnym polu, kilka annuli do kontrastu fazowego oraz ogranicznik ciemnego planu do pracy w ciemnym planie o małej mocy.
Rysunek 3. Kondensatory ciemnoziemne. 3(a) Suchy kondensator ciemnoziemny. 3(b) & 3(c) Kondensatory ciemnoziemne zanurzone w oleju. 3(d) Regulowany kondensor ciemnoziarnisty w imersji olejowej; kondensor ten może być dostosowany do różnej grubości szkiełek, w celu uzyskania wysokiej jakości obrazu ciemnoziarnistego.
Mikroskopia w świetle przechodzącym i odbitym
Układ mikroskopu w świetle przechodzącym wymaga oddzielnego kondensora, ponieważ światło jest najpierw skraplane na próbce (gdzie światło oddziałuje z materią), a następnie jest zbierane przez obiektyw dalej wzdłuż osi optycznej.
Sytuacja w mikroskopie w świetle odbitym jest inna. Tutaj tor promienia jest zagięty wokół osi próbki, gdzie światło jest odbijane od jej powierzchni. Obiektyw działa jak własny kondensor, a ustawianie mikroskopu w świetle odbitym jest bardzo uproszczone (patrz wykresy promieni w części 2 tej serii). Jednakże trudno jest uzyskać dostęp do tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu (przedniej płaszczyzny ogniskowej, gdy jest używany jako kondensor), dlatego stosuje się dodatkowe soczewki, aby stworzyć pozycję, w której obraz diafragm i filtrów jest zbieżny z tylną płaszczyzną ogniskową.
System incident-light jest bardzo użyteczny dla mikroskopii fluorescencyjnej, głównie dlatego, że oświetlenie próbki jest proste, jest bardziej wydajne (dając jaśniejsze obrazy przy dużych powiększeniach) i kombinacja z innymi metodami kontrastu przez światło przechodzące jest dozwolona.
Rysunek 4. Ilustracja epi-iluminatora do mikroskopii w świetle odbitym
Ten epi-kondensor ma dwa rodzaje obiektywów do światła odbitego zamontowane w nosku. Używany obiektyw jest przeznaczony do oświetlania ciemnego podłoża, podczas gdy dwa pozostałe obiektywy, które można zobaczyć, są przeznaczone do pracy w jasnym polu w świetle odbitym. Szerokie kołnierze wokół tych dwóch ostatnich obiektywów umożliwiają centrowanie obiektywu na osi optycznej. Litera „D” na obudowie epiluminatora oznacza wymienną wkładkę, która umożliwia wykorzystanie urządzenia do oświetlania ciemnego pola. Może on zostać wymieniony na lusterko płaskie do mikroskopii jasnego pola w świetle odbitym. Kondensor światła przechodzącego został usunięty spod stolika.
Jeśli obiektyw działa jako własny kondensor w mikroskopii światła odbitego, dlaczego obiektywy nie są również używane do oświetlenia w mikroskopii światła przechodzącego? Oprócz praktycznych trudności w dostępie do tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu, trudno jest wykorzystać obiektywy do wielu funkcji, a kąt oświetlenia nie jest zazwyczaj regulowany (przez diafragmę irysową w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu).
Podstawowe zasady wzmacniania kontrastu
Wystarczająca widoczność, lub kontrast, jest wymagana, abyśmy mogli postrzegać szczegóły w obrazie, który jest rozwiązywany przez nasze mikroskopy. Selektywność jest ważna: potrzebujemy przynajmniej pewnych różnic regionalnych w obiekcie, oraz między obiektem a tłem, aby dostrzec szczegóły.
Kontrast w obrazie jest uzyskiwany przez trzy środki, oddzielnie lub w połączeniu. Są to:
- interakcja przedmiot-światło,
- manipulacja oświetleniem, i
- manipulacja medium rejestrującego obraz.
Zmiana kontrastu w części (c) może być osiągnięta przez fotograficzne wywoływanie i/lub drukowanie, a także przy użyciu elektronicznego kontrastu analogowych obrazów wideo lub cyfrowych. Jednakże, kondensor jest instrumentem w części (a) i (b) do manipulowania kontrastem i widocznością w obrazie. Dalsze szczegóły dotyczące teoretycznych i praktycznych aspektów technik kontrastowych w mikroskopii świetlnej można znaleźć w Bradbury & Evennett, 1996 i Sanderson, 2002, 2000, 1998 i 1994. W skrócie, najbardziej znanymi formami generowania kontrastu są: jasne pole, skośne oświetlenie, ciemne podłoże Rheinberga, kontrast fazowy i DIC. Możliwe jest również łączenie tych metod z różnymi formami oświetlenia (np. światło spolaryzowane z Rheinbergiem lub kontrast fazowy przez transmitowane jasne pole z padającą fluorescencją). Ponieważ wzmocnienie kontrastu jest w dużym stopniu pod kontrolą mikroskopisty, nie można przecenić znaczenia właściwego użycia kondensora.
Kondensor musi być właściwie zogniskowany (patrz część 3, ustawianie mikroskopu do oświetlenia Köhlera), aby uzyskać obraz najlepszej jakości. Dotyczy to każdej metody wzmacniania kontrastu (jasne pole, faza, ciemne tło). Najbardziej oczywistym skutkiem nieostrości kondensora w mikroskopii jasnego pola jest znaczna utrata zdolności rozdzielczej, co z kolei daje „zgniły” obraz z aureolami dyfrakcyjnymi wokół każdego punktu obrazu. Ten sam rezultat występuje, gdy górna (krótkoogniskowa) soczewka jest pominięta lub pozostawiona odwrócona, gdy używany jest obiektyw o dużej mocy, a tylna płaszczyzna ogniskowa obiektywu nie jest całkowicie wypełniona światłem.
Gdy mikroskopia kontrastu fazowego jest próbowana z nieprawidłowo zogniskowanym kondensorem, pierścień w kondensorze często nie pasuje do średnicy pierścienia fazowego w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, a każde wzmocnienie kontrastu jest utracone. Problemy z ogniskowaniem kondensora mogą również powodować słabą mikroskopię ciemnego tła, jeśli obraz ogranicznika łaty nie zasłania całkowicie bezpośredniego oświetlenia z obiektywu. W następnej części tej serii powrócimy do obiektywu i rozważymy długość tubusu oraz jak określić ogniskową, powiększenie, aperturę i inne parametry obiektywu.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (red). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (4 tomy) 0-12-164725-0; tylko tom 3 = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.