The Discovery of Water Channels (Aquaporins)

Abstract

De beweging van water in en uit cellen is een fundamenteel biologisch proces dat essentieel is voor het leven. Deze waterbeweging regelt niet alleen de activiteit van individuele cellen, maar is ook verantwoordelijk voor het functioneren van vele orgaansystemen en voor het handhaven van de waterbalans in het gehele lichaam. Men vermoedde reeds lang dat de waterbeweging over biologische celmembranen op de een of andere manier werd bevorderd of vergemakkelijkt door poriën of kanalen, maar de zoektocht om deze kanalen te identificeren was lang en moeizaam. Zoals vaak het geval is in de wetenschap werd het geheim van het waterkanaal uiteindelijk bij toeval ontdekt in 1992 door Peter Agre en zijn collega’s aan de Johns Hopkins University in Baltimore, die werkten aan membraanproteïnen van rode bloedcellen. Dit “eerste” waterkanaal kreeg oorspronkelijk de naam CHIP28 en staat nu bekend als aquaporine 1. Voor deze ontdekking kreeg Agre in 2003 de Nobelprijs voor scheikunde. Er zijn momenteel 13 aquaporines bekend bij zoogdieren, verspreid over de meeste weefsels, maar er zijn er nog veel meer geïdentificeerd in lagere organismen en in het plantenrijk. De betrokkenheid van aquaporines bij processen zoals urineconcentratie en lichaamsvochthomeostase, hersenfunctie, klierafscheiding, huidhydratatie, mannelijke vruchtbaarheid, gehoor, gezichtsvermogen, en de meeste belangrijke lichaamsfuncties die men zich maar kan voorstellen, wordt nu allemaal aan een intens wetenschappelijk onderzoek onderworpen. Bovendien zijn defecten in de werking van aquaporines in verband gebracht met verschillende ziektebeelden en pathologische toestanden. Dit korte overzicht zal hun achtergrond, ontdekking, en functie in geselecteerde lichaamsprocessen bespreken, met name gericht op hydratatie.

© 2017 The Author(s) Published by S. Karger AG, Basel

Waarom zijn we geïnteresseerd in waterkanalen?

De cellen die ons lichaam vormen, bestaan meestal uit water. Ongeveer 65% van een cel bestaat uit water. In termen van totale lichaamsmassa zijn baby’s het meest “sappig”, zij bestaan voor 75% uit water; magere volwassenen bevatten 60% water, terwijl oudere volwassenen slechts 50% water bevatten. Het grootste deel van het niet-water, droge gewicht in het lichaam bestaat uit botten. Ter vergelijking: het meest waterrijke organisme is misschien wel de sla (95% water), terwijl wij mensen vergelijkbaar zijn met een banaan (65% water). Tijdens de evolutie zijn cellen in alle organismen geëvolueerd om optimaal te werken in een dergelijke waterige omgeving, en aanzienlijke variaties in het cellulaire watergehalte zullen hun moleculaire componenten concentreren of verdunnen en een normale functie verhinderen. Daarom moeten cellen de hoeveelheid water die hun plasmamembraan binnenkomt en verlaat, reguleren om de cytosolische concentratie van oplosmiddelen, ionen, elektrolyten, eiwitten en nucleïnezuren te regelen. Bovendien wordt de hoeveelheid water in de extracellulaire ruimten binnen een organisme ook strak geregeld. Bij mensen en andere zoogdieren omvat dit, maar is niet beperkt tot, het bloedvolume, de interstitiële ruimte buiten de bloedvaten, de cerebro-spinale vloeistof, de waterige humor in het oog, en de klierafscheidingen.

Waarom hebben wij waterkanalen nodig?

Om het hoofd te bieden aan de voortdurend veranderende metabolische eisen en omgevingsomstandigheden, moeten cellen snel water uitwisselen tussen hun cytoplasma (binnen) en de externe omgeving (buiten) om een constant volume te behouden. Dit is belangrijk voor veel lagere organismen die uitgebreide mechanismen voor celvolumeregeling hebben ontwikkeld, en waarbij meestal niet alleen watertransport maar ook ionenstromen (meestal Na+, K+, en Cl-) over membranen plaatsvinden om te herstellen van overmatige zwelling of krimp wanneer ze worden blootgesteld aan externe vloeistoffen met verschillende osmolaliteit (bijv. van zout zeewater tot verdund regenwater). Hoewel deze ionentransportmechanismen ook bij zoogdieren bestaan, wordt een groot deel van de regulerende “homeostatische” functie in hogere organismen bereikt door het handhaven van een constant intern milieu waarin onze cellen zich bevinden – het beroemde “milieu intérieur” of “de zee binnenin” zoals gedefinieerd door Claude Bernard . Dit wordt voor een groot deel bereikt door de werking van de nieren, die in coördinatie met de hersenen het plasmavolume en de plasmaconcentratie (osmolaliteit) meten en daarop reageren door de hoeveelheid water die zij afgeven in de urine te verhogen of te verlagen. Hierop zal hieronder nader worden ingegaan.

Naast het handhaven van het celvolume stelt de snelle uitwisseling van water tussen cellen weefsels en organen in staat water uit te scheiden en/of op te nemen als onderdeel van hun fysiologische functie. Epitheelcellen die sommige nierbuisjes bekleden zijn bijzonder goed aangepast aan deze functie, maar cellen in andere orgaansystemen kunnen ook de transepitheliale waterbeweging reguleren om functioneel belangrijke processen mogelijk te maken. Bijvoorbeeld, de vloeistoffen die worden afgescheiden door de alvleesklier, de galbuis, de traanklier, speeksel- en borstklieren, evenals de plexus choroidea en het pigmentepitheel van het netvlies, hebben allemaal te maken met een snelle transepitheliale waterbeweging.

Hoe beweegt water zich in en uit de cellen?

Al deze fysiologische processen hebben te maken met waterbeweging over de celmembranen. Het is al lang bekend dat wanneer de meeste cellen in gedestilleerd water worden geplaatst, zij aanzienlijk opzwellen en uiteindelijk kunnen barsten. Wanneer cellen daarentegen in een zoutoplossing worden geplaatst die geconcentreerder is dan de zouten en andere bestanddelen in hun cytoplasma, zullen zij krimpen. Dit proces is voor een groot deel het gevolg van osmotische waterstroming, op- of neerwaarts over een concentratiegradiënt, in een poging van het systeem om de osmotische concentratie aan beide zijden van het celplasmamembraan in evenwicht te brengen. Maar hoe beweegt water zich precies over het celmembraan? Met behulp van een speciaal apparaat dat het opzwellen en krimpen van rode bloedcellen kan meten, een experimenteel model dat gemakkelijk te verkrijgen en te manipuleren is, kwamen onderzoekers tot de conclusie dat water 2 routes door membranen heeft. Toen het osmotisch opzwellen en krimpen bij verschillende temperaturen werd gevolgd, ontdekte Solomon een langzaam, temperatuursgevoelig proces, waarop een veel sneller, temperatuursonafhankelijk proces werd gesuperponeerd (Fig. 1). Het langzame proces weerspiegelde de diffusie van water over de vette lipide bilaag van het plasmamembraan – diffusie is temperatuurgevoelig. Maar het snelle proces kwam overeen met de aanwezigheid van waterige poriën in het membraan, die de snellere, osmotisch gedreven passage van water mogelijk maakten, waarbij geen diffusie optrad (Fig. 1). Macey en Farmer en anderen toonden vervolgens aan dat de verbinding kwikchloride de snelle component van dit proces aanzienlijk kon remmen, hetgeen wees op de aanwezigheid van een eiwitporie – of waterkanaal – binnen het membraan. Kwikchloride bindt zich aan sulfhydrylgroepen (cysteïneresiduen) op eiwitten en remt hun functie: in dit geval de waterdoorlaatbaarheid. Dit onderzoek, dat gericht was op rode bloedcellen, heeft dus duidelijk het concept geverifieerd dat waterporiën verantwoordelijk zijn voor de snelle, temperatuursongevoelige, osmotisch gedreven passage van water over biologische membranen. Zoals we zullen zien, werden deze poriën later geïdentificeerd als de aquaporines.

De nier regelt het watergehalte in ons lichaam

De nier is een opmerkelijk orgaan dat vooral bekend is om het “filteren” van het bloed om afvalstoffen zoals ureum en andere toxines te verwijderen en om urine te produceren. Per dag wordt ongeveer 180 liter bloed gefilterd, maar de meeste mensen produceren slechts ongeveer 1,5 liter urine. De precieze hoeveelheid hangt af van hoeveel u drinkt, hoe warm het is, en hoeveel u sport (waardoor u water verliest door te zweten). Ongeveer 90% van het gefilterde vocht wordt verwijderd in de proximale regio’s van de nieren en deze waarde is bij de meeste mensen vrij constant. De resterende 10% (18 L) wordt echter weer opgenomen in het verzamelriool van de nier onder invloed van het antidiuretisch hormoon vasopressine (VP). VP wordt door de achterste hypofyse afgegeven als reactie op uitdroging (waardoor de osmotische concentratie van het serum toeneemt) of volumeverlies. Het werkt via een specifieke receptor, de vasopressinereceptor (V2R), in op de epitheelcellen van de verzamelbuis in de nieren om de waterreabsorptie te stimuleren, waardoor het probleem wordt gecorrigeerd en de bloedconcentratie en/of het bloedvolume weer op een normaal niveau worden gebracht. Het mechanisme waarmee VP deze vochtopname door het epitheel van de verzamelbuis veroorzaakt, wordt nu vrij goed begrepen en omvat aquaporine waterkanalen.

De urineblaas van de pad als model voor de nier

Het is de moeite waard om een stap terug te doen en te kijken naar hoe het werkingsmechanisme van VP experimenteel werd onderzocht. Hoewel de effecten van VP op de nierfunctie al enige tijd bekend waren, was voor een gedetailleerde ontleding van de cellulaire werking een modelsysteem nodig dat toegankelijker was dan de nier. Het is zeer moeilijk (maar niet onmogelijk) om met afzonderlijke nierbuisjes te werken, omdat zij zo klein zijn – slechts ongeveer 40 µm in diameter. Een belangrijke doorbraak in het onderzoek kwam er toen Bentley (en anderen) ontdekten dat de urineblaas van de pad ook water transporteert als reactie op het antidiuretisch hormoon. Dit is een natuurlijk onderdeel van hun overlevingsproces in het wild. Wanneer hij in water wordt ondergedompeld, absorbeert de pad water via zijn huid en produceert hij veel zeer verdunde urine, die hij opslaat in een grote, ballonachtige blaas. Wanneer de pad slechts beperkt toegang heeft tot vijverwater en begint uit te drogen, komt zijn eigen antidiuretisch hormoon (vasotocine, een analoog van VP) vrij, waardoor het blaasepitheel doorlaatbaar wordt voor water. Zo wordt het in de blaas opgeslagen water teruggevoerd naar het bloed om het dier opnieuw te hydrateren. In wezen draagt de pad zijn eigen flessen water met zich mee in zijn blaas. De urineblaas van de pad werd zo een veel gebruikt surrogaat voor het onderzoeken en begrijpen van VP-geïnduceerde waterstroom door het nier-verzamelkanaal-epitheel.

Jarenlang werd de blaas van de pad gebruikt om het begin en het einde van VP-werking op de waterstroom door epitheelcellen te onderzoeken. Vele cellulaire signaalwegen die dit proces stroomafwaarts van de VP-receptor interactie reguleren werden geïdentificeerd. Een van de meest intrigerende bevindingen die uit de vele studies naar de paddenblaas naar voren kwamen, was het concept van waterkanalen die in het plasmamembraan van deze epitheelcellen worden ingebracht om de membraan- en dus ook de epitheliale waterdoorlaatbaarheid te vergroten. Wanneer de hormonen werden verwijderd, werden deze “waterkanalen” uit het plasmamembraan verwijderd door internalisatie in de cel (een proces dat endocytose wordt genoemd), waardoor het membraan weer zijn ondoordringbare basistoestand bereikte en waterstroming werd verhinderd. Dit idee werd gepubliceerd door Wade, die de term “shuttle hypothese” bedacht om het heen en weer bewegen van waterkanalen van en naar het celoppervlak te beschrijven naar analogie met de NASA space shuttle. Maar de aard van deze waterkanalen bleef onbekend.

De ontdekking van Aquaporine waterkanalen

Ondanks vele pogingen om het eiwit te identificeren dat waterkanalen vormde, was het veld in wezen vele jaren bevroren in de tijd. Alle gerichte pogingen om het eiwit te isoleren uit gezuiverde membranen van erytrocyten uit paddenblazen en uit de nier hadden slechts beperkt succes, hoewel sommige publicaties in de buurt kwamen en andere belangrijke informatie verschaften, zoals informatie over de molecuulgrootte (ongeveer 30 kD) . En zo gebeurde het dat de Agre groep, terwijl zij naar Rhesus factor eiwitten in rode celmembranen keken, een consistente “verontreinigende” band op hun gels opmerkten van rond de 28 kD . In plaats van deze informatie terzijde te schuiven, groeven zij nog wat dieper en concludeerden dat dit wel eens het veel gezochte waterkanaal in rode cellen zou kunnen zijn. Het werd geïsoleerd en gezuiverd, en antilichamen toonden aan dat het ook tot expressie kwam in cellen van de proximale tubuli van de nier en de dunne afdalende ledematen van Henle – beide zijn constitutief zeer waterdoorlatend. Zou dit het waterkanaal kunnen zijn? Het beslissende moment kwam toen de Agre groep mRNA dat codeerde voor dit eiwit injecteerde in een in vitro expressiesysteem, Xenopus oöcyten. Het membraan van de eicel is normaal gesproken zeer ondoordringbaar voor water – de eicellen worden afgezet in zoet water en zouden openbarsten als het membraan doorlaatbaar was! Maar na injectie van mRNA dat codeert voor het vermeende waterkanaal, deden oöcyten die in gedestilleerd water waren gedeponeerd precies dat – zij barstten, terwijl de controle-oöcyten intact bleven. De Agre groep realiseerde zich dat het geïnjecteerde mRNA de oöcyten had gedwongen een nieuw eiwit te produceren dat, wanneer het door cellulaire transportmechanismen naar het membraan van de oöcyt werd verplaatst, ervoor zorgde dat het membraan zeer doorlaatbaar werd voor water. Er volgde een groot feest. Een reeks latere artikelen bevestigde dat dit nieuwe eiwit, CHIP28 genaamd (channel-forming integral membrane protein of 28 kD), het eerste waterkanaal was dat definitief werd geïdentificeerd.

The Aquaporin Family

Nadat de moleculaire identiteit van CHIP28 bekend werd, vonden anderen een reeks homologe eiwitten die een nieuwe familie vormden. Zij werden bekend als aquaporines. Toen deze naam voor het eerst werd gebruikt, waren er 4 aquaporines bij zoogdieren bekend – AQP1, 2, 3, en 4. Er zijn nu 13 aquaporines bij zoogdieren, en honderden zijn geïdentificeerd bij andere organismen, waaronder planten. Al deze aquaporines hebben dezelfde algemene structurele kenmerken, met een molecuulgewicht van ongeveer 30 kD in de niet-geglycosyleerde vorm, en verscheidene verschillende glycosylatietoestanden die resulteren in een hoger molecuulgewicht. Zij hebben alle 6 transmembraan overspannende domeinen; de C- en N-termini bevinden zich beide in het cytoplasma; zij vormen een functionele tetramer in de lipide bilaag en de structuur van de waterporie binnen het eiwit is voor sommige aquaporines opgehelderd door röntgen-kristallografie. Onverwacht is dat sommige aquaporines meer water doorlaten dan andere, en dat sommige naast water ook andere moleculen kunnen transporteren. AQP3 is bijvoorbeeld doorlaatbaar voor glycerol, en AQP9 is doorlaatbaar voor ureum. Bovendien zijn sommige aquaporines doorlaatbaar voor gassen als CO2 en NO . Het terrein van de aquaporine biologie breidt zich dus steeds verder uit, en regelmatig verschijnen er berichten over nieuwe en onverwachte functies in diverse cellen en weefsels.

Aquaporine 1 en 2 (het VP-gevoelige waterkanaal) in de nier

AQP1, het waterkanaal van de rode cel, komt sterk tot expressie in de proximale tubuli en de dunne afdalende ledematen van Henle, die beide te allen tijde zeer doorlatend voor water zijn. Deze tubuli zijn betrokken bij de reabsorptie van 90% van het gefilterde water. Een tweede aquaporine, AQP2, werd geïdentificeerd in de hoofdcellen van het verzamelbuisje van de nier. Dit zijn de cellen die (net als de blaas van de padden) hun waterdoorlatendheid veranderen als reactie op het antidiuretisch hormoon, VP, en zo de reabsorptie van het resterende vocht – bijna 20 L per dag – regelen. AQP2 is het door VP gereguleerde waterkanaal. In aanwezigheid van VP stapelt AQP2 zich op aan het oppervlak van de hoofdcellen en doorkruist water het epitheel onder invloed van een osmotische gradiënt (Fig. 2). Het basolaterale aspect van deze tubuli is hypertonisch ten opzichte van de vloeistof in het tubule lumen en water stroomt langs deze gradiënt naar beneden in aanwezigheid van VP. Het basolaterale membraan van hoofdcellen is altijd waterdoorlatend door de aanwezigheid van ofwel AQP3 of AQP4 in verschillende delen van de nier. De hoeveelheid AQP2 in het apicale membraan is dus de snelheidsbeperkende factor die de water reabsorptie in het verzamel kanaal van de nier regelt. Jarenlang onderzoek heeft aangetoond dat AQP2 recycleert tussen de plasmamembraan en cytoplasmatische blaasjes in hoofdcellen, en VP verandert het evenwicht zodanig dat meer AQP2 zich ophoopt aan het celoppervlak en minder binnenin de cel, wat verantwoordelijk is voor de membraanpermeabiliteitstoename (Fig. 2). De celbiologie die aan dit proces ten grondslag ligt wordt gedeeltelijk begrepen, en omvat een signaalcascade die in gang wordt gezet door VP interactie met zijn receptor, activering van adenylyl cyclase om intracellulair cAMP te verhogen, activering van proteïne kinase A, en fosforylering van het AQP2 eiwit. Fosforylering is de kritische gebeurtenis die membraanaccumulatie van AQP2 veroorzaakt, en verschillende laboratoria zijn betrokken bij studies om dit proces verder te begrijpen. De geïnteresseerde lezer wordt verwezen naar recente gedetailleerde reviews over dit proces.

Pathofysiologie van Aquaporines

Zoals te verwachten is, zijn aquaporines betrokken bij verschillende ziekten, met name in de nieren (Fig. 3). Storingen of mutaties in AQP2 of, meer algemeen, in V2R veroorzaken nefrogene diabetes insipidus (NDI), waarbij patiënten niet in staat zijn hun urine te concentreren en theoretisch tot 18 L verdunde urine per dag kunnen lozen, d.w.z. de hoeveelheid die normaliter in het verzamelcircuit wordt gereabsorbeerd. Vanwege andere compensatiemechanismen produceren de meeste patiënten met NDI tussen 5 en 10 liter per dag. De beschikbare therapieën kunnen de symptomen slechts gedeeltelijk verlichten en er is meer werk nodig om betere behandelingen te vinden. De meest voorkomende oorzaak van NDI is bij patiënten die behandeld worden met lithium voor een bipolaire stoornis. Lithium veroorzaakt een ernstige downregulatie van het AQP2 gen om redenen die niet volledig worden begrepen. Hoewel het een zeer effectieve therapie voor bipolaire stoornis is, maken deze en andere bijwerkingen veel patiënten terughoudend om aan een lithiumkuur te beginnen. Andere AQP-gerelateerde aandoeningen, meestal geïdentificeerd in knock-out diermodellen , zijn een defect in de urineconcentratie (AQP1 mensen zijn geïdentificeerd), cataract (AQP0), beroerte (AQP4), en broze huid als gevolg van gebrekkige hydratatie (AQP3). AQP1 en AQP2 zijn ook betrokken bij celmigratie en wondgenezing. Tenslotte heeft de aantrekkingskracht van aquaporines de aandacht getrokken van reclamebureaus die bijvoorbeeld betrokken zijn bij de cosmetica-industrie. Google het en zie!

Toekomstige richtingen

Een opwindend gebied in de aquaporine biologie is het ontstaan van zogenaamde maanlichtfuncties van deze kanaaleiwitten. Deze kunnen gerelateerd zijn aan hun kanaalfunctie, zoals in het geval van de gasdoorlaatbaarheid van AQP1, of niet gerelateerd aan de kanaalactiviteit, zoals in het geval van AQP2, dat betrokken is bij de ontwikkeling van de nieren via zijn interactie met integrines en de extracellulaire matrix. Toekomstige studies zullen ongetwijfeld meer onverwachte eigenschappen van de aquaporines aan het licht brengen. Een groot aantal aquaporines wordt gevonden in “lagere” soorten, zoals planten, microben en schimmels, die geen zoogdieren zijn. Dit opent de deur om deze informatie te gebruiken om de groei en aanpassing van planten te verbeteren door de AQP-functie te stimuleren, en om microbiële en schimmelinfecties te bestrijden door aquaporines te remmen. Dergelijke specifieke remmers zijn nog niet beschikbaar, maar als en wanneer ze worden ontwikkeld, zouden ze ook een belangrijke rol kunnen spelen in de geneeskunde als aquaretica (om hoge bloeddruk te behandelen), en misschien bij kanker (om uitzaaiingen te blokkeren). We moeten ook nog veel leren over de celbiologie van de handel in aquaporines. Hoe worden ze in de cel verplaatst? Hoe werken ze samen met andere eiwitten? Kunnen alternatieve signaalwegen worden geïdentificeerd en gebruikt om defecte V2R signalering in NDI te omzeilen? Dit werk gaat door en belooft cellulaire geheimen te onthullen die niet alleen betrekking hebben op AQP biologie, maar ook op andere belangrijke cellulaire trafficking gebeurtenissen die betrokken zijn bij een groot aantal andere menselijke ziekten.

Acknowledgements/Disclosure Statement

D.B. en zijn collega’s in het MGH Program in Membrane Biology hebben voortdurende steun ontvangen voor werk aan aquaporines van de National Institutes of Health, momenteel grant nummer DK096586. D.B. ontving van Danone Research de vergoeding van reiskosten en registratiekosten voor het bijwonen van de H4H Scientific Conference.

Author Contacts

Artikel / Publicatie Details