Na zijn afstuderen aan de Southwest Texas State University in San Marcos, Texas, trad Boothe toe tot het repertoiregezelschap van het Oregon Shakespeare Festival, met rollen in o.a. Henry IV, Part 2 (in de rol van Henry IV van Engeland) en Troilus and Cressida. Zijn toneeldebuut in New York was in 1974 in de Lincoln Center productie van Richard III. Vijf jaar later maakte hij zijn Broadway-debuut in een hoofdrol in het eenakter Lone Star, geschreven door James McLure.
Boothe kreeg voor het eerst nationale aandacht in 1980, toen hij Jim Jones speelde in de CBS-TV film Guyana Tragedy: The Story of Jim Jones. Boothe’s vertolking van de gestoorde sekteleider kreeg lovende kritieken. In Time’s verhaal over de productie, werd Boothe geprezen: “Er is een buitengewone prestatie. Een jonge acteur genaamd Powers Boothe vangt al het charisma en kwaad van ‘Dad’, Jim Jones.” Boothe won de Emmy Award voor zijn rol, en versloeg daarmee veteranen Henry Fonda en Jason Robards. Toen de Screen Actors Guild in staking was in de herfst van 1980, was hij de enige acteur die de picketlijnen overstak om de ceremonies bij te wonen. Hij zei toen: “Dit is misschien wel het moedigste moment uit mijn carrière of het domste.”
Boothe portretteerde Philip Marlowe in een tv-serie gebaseerd op de korte verhalen van Raymond Chandler voor HBO in de jaren tachtig. Hij speelde in films als Southern Comfort, A Breedwn Apart, Red Dawn, The Emerald Forest, Rapid Fire en Extreme Prejudice, en in de HBO-films Into the Homeland en By Dawn’s Early Light. Daarnaast was hij te zien in de CBS-TV film Family of Spies uit 1990, waarin hij verrader Navy Officer John Walker speelde. Boothe speelde Curly Bill Brocius in de hit Western Tombstone (1993), de ontrouwe legerofficier in Blue Sky (tegenover de Oscarwinnende Jessica Lange) en de sinistere terrorist in Sudden Death. Hij maakte ook deel uit van de grote casts voor Oliver Stone’s Nixon (als stafchef Alexander Haig) en U Turn (als de sheriff van de stad).
In 2001 speelde hij de hoofdrol als Flavius Aëtius, de Romeinse generaal die de invasie van de Hunnen moest tegenhouden in de tv-maak-voor-televisie miniserie Attila. Boothe speelde een hoofdrol als bordeelhouder Cy Tolliver in de HBO-serie Deadwood, en de louche Senator Roark in de speelfilm Sin City (2005), evenals het vervolg daarop, Sin City: A Dame to Kill For (2014). Hij is de stem van een van de personages in het videospel Area 51 uit 2005 en van Gorilla Grodd, de hyperintelligente telepathische supervillain in Justice League en Justice League Unlimited. Hij sprak de schurk, Kane, in het videospel Turok uit 2008.
Hij was een speciale gastster in 24, waar hij Vice President Noah Daniels speelde. Hij keerde terug in de prequel van het zevende seizoen, 24: Redemption. Net nadat hij de rol van waarnemend president op zich heeft genomen, is Boothe te zien bij het verlaten van Air Force Two met F-15’s op de achtergrond. Boothe speelde een neergestorte F-15 piloot in Red Dawn. In maart 2008, vertelde hij een tv-campagne advertentie voor Senator John McCain’s presidentiële campagne.
In 2012, Boothe verscheen in Joss Whedon’s The Avengers in een geheimzinnige rol als een schimmige regering superieur aan S.H.I.E.L.D. In 2015-16 herhaalde hij de rol, nu Gideon Malick genaamd, in ABC’s Agents of S.H.I.E.L.D.
Boothe verscheen in 2012 in de miniserie Hatfields & McCoys als rechter Valentine “Wall” Hatfield. Boothe werd ook gecast als Lamar Wyatt in de ABC muzikale dramaserie Nashville. Boothe leende ook zijn stem aan Hitman: Absolution, een 2012 video game ontwikkeld door IO Interactive, als stem van het personage van Benjamin Travis.