PMC

TEXT

Streptokokken zijn de meest voorkomende bewoners van de menselijke mond (6, 24), en ze krijgen vaak toegang tot de bloedbaan via parodontale laesies of schaafwonden in de mond die ontstaan door routineactiviteiten (32). Dit kan leiden tot ernstige ziekten, waaronder infectieuze endocarditis (IE) (28) en neutropene bacteriëmie (29). De taxonomie van de orale streptokokken is lange tijd een bron van verwarring geweest (4, 9, 20, 22, 31). Sequenering van het 16S rRNA-gen heeft de situatie enorm verduidelijkt (13); deze benadering mist echter de gevoeligheid die nodig is om bepaalde nauw verwante soorten, waaronder Streptococcus mitis en Streptococcusalis (12), van elkaar te onderscheiden, of om stamtypering of fylogenetische analyse binnen soorten mogelijk te maken. Genen met een grotere variabiliteit zijn daarom onderzocht, waaronder de 16S-23S rRNA intergenic transcribed spacer (ITS) (2), eiwitcoderende huishoudelijke genen (1, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 23), of beide (17, 18). Er is nog geen consensus over welk(e) gen(en) het meest geschikt is/zijn voor deze doeleinden. Verder, hoewel eerdere studies orale streptokokken hebben geïdentificeerd uit klinische bloedkweken met gebruikmaking van definitieve sequencing methoden (12, 23, 30), heeft geen enkele studie gedetailleerde klinische informatie over de onderliggende ziekte gerapporteerd. Wij wilden beide doen.

Bloedstroomkweken, uitgevoerd in het Virginia Commonwealth University Medical Center Hospital van mei 2003 tot mei 2008, werden vermoedelijk geïdentificeerd als bevattende streptokokken door het klinisch microbiologisch laboratorium. Een computerscript werd gebruikt om niet-orale soorten uit te sluiten. Om analyse van contaminanten te voorkomen, werden isolatieplaten alleen aangevraagd wanneer twee of meer meldingen afkomstig waren van afzonderlijke kweken van dezelfde patiënt. Eén kolonie van elke beschikbare isolatieplaat werd gekweekt in een bouilloncultuur en macroscopisch en microscopisch onderzocht. Als er verschillen werden waargenomen in afzonderlijke kweken van dezelfde patiënt, werden beide kweken behouden. Anders werd één kweek van elke patiënt gecryopreserveerd en werden aliquots verwijderd voor PCR amplificatie.

Om de soortidentiteit en fylogenetische verwantschap van elk isolaat te bepalen, werd de 16S-23S ITS geamplificeerd met de eerder beschreven 6R en 13BF primers (2). Toen van sommige isolaten geen producten werden verkregen, stelden we vast dat de laatste drie nucleotiden van de 6R-primer niet uitgelijnd waren met 23S rRNA-sequenties in GenBank van verscheidene interessante soorten. Daarom hebben we de 6R-primer ingekort en vereenvoudigd tot 6R-S, en de 13BF-primer ingekort tot de annealingtemperatuur ervan (zie Tabel S1 in het supplementaire materiaal). Een soortgelijke wijziging van de 6R primer werd onlangs gemeld (18). Met behulp van deze primers werden PCR-amplicons verkregen van alle isolaten en ingestuurd voor capillaire DNA-sequentieanalyse.

De meeste DNA-sequenties bevatten de volledige ITS en delen van de 16S en 23S rRNA-genen, die werden uitgelijnd met ITS-sequenties van type-stammen die beschikbaar zijn in GenBank of door ons bepaald uit stammen verkregen van de American Type Culture Collection (ATCC). Wij hebben vastgesteld dat flankerende 16S- en 23S-sequenties, die in de meeste gepubliceerde sequenties niet voorkomen, de ITS-uitlijning vergemakkelijkten. Er zijn inderdaad ten minste vier sequenties van typestammen gepubliceerd (18) waarin een CTAAGG gelegen 78 bp vóór het 3′ einde van het 16S rRNA gen verward lijkt te zijn met een identieke hexanucleotide sequentie die eerder (2) gedefinieerd is als het begin van de ITS. De getrimde ITS-sequenties (2) werden vervolgens vergeleken en uitgelijnd met MEGA 4 software (25) om een fylogenetische boom met buurlanden te construeren (fig. 1).

Er is eerder gesuggereerd dat ITS-analyse alleen voldoende is voor soortidentificatie van orale streptokokken, inclusief die van de nauw verwante soorten S. mitis en S. oralis. Geconserveerde single-base deleties op twee plaatsen en een totale ITS lengte van 246 bp werden gesuggereerd kenmerkend te zijn voor S. oralis, terwijl S. mitis werd voorgesteld de deleties te missen en een ITS van 248 tot 249 bp te bezitten (2, 3). In onze studie vonden we isolaten van beide soorten die beide deleties of geen van beide bezaten, samen met overlappende ITS-lengtes. De isolaten van S. oralis en S. mitis konden dus niet op betrouwbare wijze van elkaar onderscheiden worden op basis van deze criteria. Een andere studie heeft gesuggereerd dat ITS-sequentieanalyse, hoewel niet voldoende voor het onderscheiden van S. of S. mitis, wel voldoende is voor de identificatie van veel andere orale streptokokkensoorten, waaronder die welke behoren tot de anginosus-groep (18). Wij vonden echter één isolaat van de anginosusgroep-soort S. intermedius (VMC38) dat niet door ITS kon worden geclassificeerd (zie Tabel S1 in het supplementaire materiaal).

Een groot aantal isolaten, met name voor S. mitis en Streptococcus constellatus, bezat ook identieke sequenties, waardoor fylogenetische analyse onmogelijk was. Identieke sequenties werden ook verkregen uit vijf paren isolaten afkomstig van dezelfde patiënten (gegevens niet weergegeven).

Omdat de ITS-analyse niet voldoende was voor onze doeleinden, hebben we een tweede gemeenschappelijk doelwit gesequeneerd – het sodA-gen, dat codeert voor mangaan-afhankelijk superoxide dismutase (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Dit maakte de uitsluiting van verschillende isolaten mogelijk. De stammenparen waarvan hierboven werd vermeld dat ze van dezelfde proefpersonen afkomstig waren en identieke ITS-sequenties hadden, hadden ook identieke sodA-sequenties, wat bevestigde dat de isolaten identiek waren, en één isolaat van elk paar werd verwijderd. Twee isolaten vielen af door een kennelijke vergissing bij het hanteren van de stammen, en een ander werd niet weerhouden omdat de ITS- en sodA-sequenties aangaven dat het om een stam van Enterococcus faecalis ging. Een fylogenetische boom afgeleid van de resterende isolaten wordt getoond in Fig. 1.

De sodA alignment was superieur aan die van de ITS voor fylogenetische analyse. De enige isolaten met identieke sodA-sequenties waren twee S. mitis-stammen en twee stammen van Streptococcus vestibularis. De sodA-reeks was ook bruikbaarder voor soortbepaling. Alle referentiestammen waren goed van elkaar gescheiden in de fylogenetische boom. Het resultaat was slechts vier dubbelzinnige soortsbepalingen voor sodA, vergeleken met 15 voor de ITS (zie Tabel S1 in het aanvullend materiaal). In die gevallen waarin één enkele soortnaam consistent was met zowel de ITS- als de sodA-sequenties, werd die naam gebruikt. Slechts 3 van de uiteindelijk 58 klinische isolaten konden niet met zekerheid volgens deze methode worden geïdentificeerd. De VMC1 en VMC43 isolaten produceerden ITS sequenties die te kort waren om informatief te zijn, ondanks herhaalde sequencing pogingen, en VMC58 werd inconsistent geïdentificeerd door ITS en sodA sequenties (Fig. 1; Tabel S1). We bevestigden de soortidentiteit van deze isolaten door gebruik te maken van een recent gepubliceerde database met sequenties van zeven huishoudgenen van 420 goed gekarakteriseerde streptokokkenstammen, waaronder sodA, pfl, en pyk (1). De sequenties van de pfl- en/of pyk-genen van alle twijfelachtige stammen werden bepaald en uitgelijnd met de sequenties in de eMLSA.net database (http://www.emlsa.net/), evenals de bestaande sodA-sequenties. In alle gevallen waren de pfl- en pyksoortentoewijzingen in overeenstemming met die van sodA. Bovendien toonde de sodA-reeks aan dat de VMC58-sequentie, hoewel afwijkend van de type-stam, binnen een cluster van 13 Streptococcus infantis-isolaten in de database viel (gegevens niet weergegeven). De consensus soortidentificatie van alle isolaten opgenomen in de studie zijn aangegeven in Fig. 1 en Tables S1 en S2 in het supplementaire materiaal.

Hoewel deze resultaten suggereren dat sodA analyse alleen voldoende is voor het identificeren van de meeste stammen, bevelen wij aan om ten minste één extra eiwit-coderend housekeeping gen op te nemen voor alle stammen. Veel orale streptokokken zijn van nature competent en er zijn gevallen gerapporteerd van verwerving van vreemde huishoudgenen, waaronder sodA (1, 12). Dit was niet duidelijk in onze studie, maar er waren gevallen van chimere ITS (VMC38 en VMC50) en sodA (VMC33) sequenties. Twee recente publicaties zijn verder gegaan, waarbij telkens sequentiebepaling van een andere set van zeven huishoudgenen voor multilocus sequentietypering (7) of multilocus sequentieanalyse (1) werd voorgesteld. Deze benaderingen berusten op de analyse van een groter aantal genen om een hogere resolutie te verkrijgen en om de effecten van incidentele chimere of vreemde genen te minimaliseren (1, 7). Deze schema’s maken ook meer verfijnde fylogenetische analyses mogelijk dan mogelijk is met slechts twee of drie genen. Wij hebben echter af en toe moeilijkheden ondervonden bij de amplificatie en sequencing van pfl en pyk en weinig succes met twee van de andere aanbevolen genen, map en ppaC (1). Een andere recente studie meldde soortgelijke moeilijkheden (27). De keuze van bijkomende genen kan dus empirische testen vereisen, maar diegene die gebruikt worden in de zeven-gen analyses moeten eerst onderzocht worden, aangezien grote verzamelingen sequenties van goed gekarakteriseerde stammen beschikbaar zijn voor vergelijking (1, 7).

Voor zover wij weten, is dit slechts het tweede verslag van een Streptococcus australis (12) of S. infantis (30) bloedkweek isolaat. De enige andere associatie van deze laatste soort met een ziekte komt van twee rapporten van zijn isolatie uit het sputum van volwassenen met cystic fibrosis (17, 26). Het is daarom interessant dat een volwassene met cystische fibrose de bron was van ons S. infantis isolaat, VMC58 (zie Tabel S2 in het supplementaire materiaal).

Antibioticagevoeligheidsgegevens zijn opgenomen in Tabel S2 en zijn grotendeels in overeenstemming met eerdere studies (8). Tabel S2 geeft ook klinische en demografische gegevens voor de bronpatiënten, waarbij ze zijn gecategoriseerd op basis van de voornaamste onderliggende ziekte: medische ziekte, maligniteit, IE, of chirurgie/trauma. Alle IE-proefpersonen werden klinisch gediagnosticeerd, en allen behalve het geval van VMC56 (Tabel S2) werden volgens de gemodificeerde Duke-criteria als “definitieve IE” geclassificeerd (16). De enige uitzondering had een voorgeschiedenis van eerdere IE en intraveneus druggebruik (IVDU), wat in combinatie met de positieve bloedkweken zou resulteren in categorisatie als “mogelijke IE”. Gegevens over mogelijke infectiebronnen, waaronder centrale lijnen, gastro-intestinale endoscopie, orale mucositis, tandheelkundige aandoeningen en IVDU, werden ook onderzocht. IVDU werd aangetroffen bij 9 van de 13 IE-patiënten en bij slechts 1 andere patiënt in de studie (Tabel S2). Dit verschil was statistisch significant (P < 0,0001; Fisher’s exact test). Dus, hoewel deze studie gericht was op orale species, was IVDU een overweldigende risicofactor.

Onze fylogenetische analyse bracht geen statistisch significante associaties aan het licht tussen een bepaalde species of clonaal type en onderliggende ziekte of andere klinische parameters, waaronder aantal witte bloedcellen, hoogste temperatuur, grootte van de vegetatie, aangetaste klep, of overlijden van de patiënt. Eén eerdere studie bevatte voldoende informatie om soorten geïsoleerd van neutropene patiënten te identificeren (12). Onze resultaten waren vergelijkbaar, in die zin dat 11 van de 12 isolaten in die studie en 9 van de 10 in de onze (Tabel S2) ofwel S. mitis ofwel de nauw verwante S. oralis waren. In onze studie hadden deze twee soorten samen significant meer kans dan de 12 andere soorten samen om geïsoleerd te worden van neutropene patiënten (P = 0,004; Fisher’s exact test). Dit kan wijzen op de prevalentie van deze soorten in de mondholte. Het is echter interessant dat deze trend zich niet doorzette naar IE. Wanneer we onze gegevens combineren met die van dezelfde studie (12) voor neutropenie en IE, werden S. oralis en S. mitis geïsoleerd uit 20 van 22 neutropenie gevallen en slechts 15 van 27 IE gevallen, een verschil dat statistisch significant was (P = 0,01; Fisher’s exact test). Zoals in vorige studies (11, 12, 30), beperkte het aantal monsters ons vermogen om andere mogelijke associaties tussen species en bepaalde ziektes of klinische kenmerken met zekerheid te beoordelen. Door de definitieve identificatie van de soorten echter te koppelen aan klinische en demografische kenmerken voor elke bronpatiënt (Tabel S2), hebben we getracht onze resultaten geschikt te maken voor meta-analyse of andere studies die gecombineerde gegevens gebruiken.