Plaque Assay

De plaque-assay kan worden gebruikt om een klonale viruspopulatie te zuiveren of om de virale titer te bepalen als plaque-vormende eenheden per ml (pfu/ml), zodat bij latere werkzaamheden bekende hoeveelheden virus kunnen worden gebruikt om cellen te infecteren. Bij deze test worden celmonolayers geïnfecteerd met een lage verhouding virus, zodat sporadische cellen geïnfecteerd raken. Een deklaag van agarose houdt de cellen stabiel en beperkt de verspreiding van het virus. Wanneer elke geïnfecteerde cel virus produceert en uiteindelijk sterft, worden alleen de onmiddellijk aangrenzende cellen geïnfecteerd. Elke groep geïnfecteerde cellen wordt een plaque genoemd. De plaques worden omringd door niet-geïnfecteerde cellen. Na verschillende infectiecycli beginnen de geïnfecteerde cellen in het centrum van de plaques te lyseren en blijven de geïnfecteerde cellen aan de rand omgeven door niet-geïnfecteerde cellen. Dit verschijnsel veroorzaakt een andere breking van het licht dat door de geïnfecteerde cellen gaat dan dat van de omringende niet-geïnfecteerde cellen, en de plaque kan met het blote oog of met lichtmicroscopie worden gevisualiseerd. Elke plaque vertegenwoordigt één enkel virus. Daarom kunnen klonale viruspopulaties worden gezuiverd door afzonderlijke plaques te isoleren. Individuele plaques die uit verschillende verdunningen van een virusbestand zijn verkregen, kunnen worden geteld om de virale titer (pfu/ml) van een bepaalde transfectie of virusbestand te bepalen. De conditie van de cellen en hun gelijkmatige verdeling over het oppervlak van de weefselkweekplaat is belangrijk voor het succes van een plaqueproef. De cellen moeten gezond zijn, > 95% levensvatbaar, en in log-fase groeien op het tijdstip van de bepaling. Klonterige cellen, cellen die niet gelijkmatig in de juiste dichtheid (>70%) over de plaat zijn verdeeld, en cellen die zich niet binnen 30 min na het uitplaten aan de weefselkweekschaaltjes hechten, zijn nadelig voor de assay.

Vereist materiaal:

Plaque Assay Agarose, Cat. Nr. 554766
Grace’s Unsupplemented Insect Cell Medium
Fetal Bovine Serum
Tissue Culture Dish, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
42°C waterbad

Protocol

Bepaal het aantal platen dat nodig is

Voor elke co-transfectie of virusstam (en positieve controle) doet u duplo’s van de seriële verdunningen (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Label elke 60 mm-plaat met monster- en verdunningsbeschrijvingen.

Zaai cultuurplaat met insectencellen

1. Zaai 2,3 x 10 6 Sf9-cellen op elke 60 mm-plaat. Schud de platen voorzichtig heen en weer en vervolgens van links naar rechts om de cellen gelijkmatig over het plaatoppervlak te verdelen. De plaat nooit ronddraaien; dit veroorzaakt een ongelijkmatige verdeling van de cellen. Laat de cellen na het bezaaien van de platen 30 minuten tot een uur hechten. Bereid gedurende deze tijd de agaroplossing en virale verdunningen voor. Visualiseer met lichtmicroscopie om >70% confluentie en een gelijkmatige celdistributie te bevestigen.

Prepareer agaroseoplossing

Geplakte cellen worden bedekt met een 1% agaroseoplossing in Grace’s Insect Cell Medium aangevuld met 10% FBS.

1. Stel eerst het waterbad gelijk aan 42°C. Bepaal het totale benodigde volume agaroplossing: vermenigvuldig 4 ml/plaat met het aantal plaque-assays. Van dit totale volume zal de helft bestaan uit geautoclaveerd dH 2 O + agarose om een 2%-oplossing te maken, en de andere helft zal Grace’s Insect Media zijn, aangevuld met 10% FBS. Om de hoeveelheid agarose in grammen te bepalen die nodig is om een uiteindelijke agaroseoplossing van 1% te maken, wordt het totale volume vermenigvuldigd met 0,01. (Bijvoorbeeld, 10 platen x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 gm.)
2. Voeg de juiste hoeveelheid geautoclaveerd dH 2 O in een steriele glazen fles van de juiste grootte. Voeg vervolgens langzaam de berekende hoeveelheid agarose toe, terwijl u zachtjes zwenkt om de dH 2 O en de agarose te mengen. Zet het mengsel in de magnetron tot het net kookt. Verwijder de fles en controleer het mengsel op onopgeloste agarose. Als er agarose aanwezig is, ga dan door met verwarmen. Herhaal dit totdat de agarose volledig is opgelost (LET OP: het mengsel en de bijbehorende stoom zijn zeer heet en kunnen brandwonden veroorzaken. Gebruik geschikte veiligheidsuitrusting/voorzorgsmaatregelen). Zodra de agarose volledig is opgelost, de fles losjes afsluiten en overbrengen in het waterbad van 42°C. Laat het mengsel afkoelen tot 42°C.
3. Breng Grace’s Insect Media en voeg Fetaal runderserum toe tot 10%. Voorbeeld: voor 100 ml Grace’s Insect Media, voeg 10 ml FBS. Plaats de Grace’s media + 10% FBS mix in het 42 ° C waterbad.

Voorbereiden virale seriële verdunningen

1. Voor elke co-transfectie, label zes 15 ml steriele buizen van 10 -1 tot 10 -6 met de juiste monster beschrijving. Voeg aan elke buis 2,7 ml TNM-FH-media toe. Voeg 0,3 ml van de co-transfectie supernatant aan de eerste buis, vortex buis. Voer seriële verdunningen uit door 0,3 ml aan de volgende verdunning toe te voegen, telkens met een verse pipet.

Infecteer monolaagcellen

1. Op dit punt hebben de cellen ruim de tijd gehad om zich aan het plaatoppervlak te hechten. Controleer verschillende platen onder een lichtmicroscoop om 70% confluentie en gelijkmatige celverdeling te bevestigen.
2. Werkend met de dubbele platen van elke verdunning, voorzichtig opzuigen van media uit de cellen met behulp van een steriele 200 µl pipetpunt en vacuüm. De celplaat niet verstoren. Voeg 1 ml van de juiste virale verdunning toe aan elk van de duplo-platen en schommel de plaat voorzichtig heen en weer en vervolgens van links naar rechts om het virus gelijkmatig te verdelen. Herhaal dit met alle overeenkomstige platen en verdunningen.
3. Gewiebel zachtjes platen bij kamertemperatuur, in steriele kap elke 15 minuten gedurende 1 uur.

Overlay geïnfecteerde cellen met agarose

1. Na 1 uur, controleer of de agarose-oplossing is op 42 ° C. De oplossing moet warm genoeg zijn zodat zij nog vloeibaar is, maar zij moet koel genoeg zijn om met de hand vast te houden. Als u de fles niet gemakkelijk kunt vasthouden, is de oplossing te heet en zullen de Sf9-cellen gedood worden. Controleer of het Grace’s Insect Media w / 10% FBS op 42°C is. Zo ja, voeg dan een gelijk volume toe aan de agaroplossing om de uiteindelijke agaroplossing te vervolledigen. Meng de agaroplossing goed.
2. Als de oplossing klaar is, plaats deze in een glazen beker gevuld met water uit het waterbad. Dit moet voorkomen dat de oplossing stolt terwijl u het onder de kap gebruikt. Controleer tijdens de procedure regelmatig de temperatuur van het water in het bekerglas. Als het begint af te koelen, vervang het met warm water uit het waterbad.
3. Werken met een tweevoudig paar per keer, voorzichtig afzuigen media van de cellen met behulp van een steriele 200 µl pipetpunt en vacuüm. Verstoor de celplaat niet. Kantel tijdens het opzuigen de plaat lichtjes en zuig het supernatans op vanaf de rand van de plaat. Dit maakt een optimale aspiratie mogelijk zonder het celvel te verstoren. Voeg daarna langzaam 4 ml agaroplossing toe aan elke plaat en laat de agar stollen.
4. Als de agar op alle platen is gestold, plaatst u de platen voorzichtig in een schone, luchtdichte incubatiekamer. Bevochtig de kamer door steriel gaas en 10 ml steriel water in een kweekschaaltje van 10 mm op het onderste rek van de incubatiekamer te plaatsen. Sluit de kamer af en plaats hem in een incubator van 27 °C. Laat de platen 6 – 10 dagen incuberen.
5. Plaques kunnen worden gevisualiseerd door de platen om te keren op een donkere achtergrond en ze te belichten met een sterke lichtbron vanaf de zijkant van de plaat, of door ze onder een hoek van 45° in een lichtbron te houden. Omcirkel bij het leren identificeren van een plaque de mogelijke plaques met een stift. Visualiseer met de lichtmicroscoop bij laag vermogen om te bevestigen dat er een gebied van opheldering is in het gazon van cellen. Visualiseer op hoog vermogen om te zoeken naar geïnfecteerde cellen aan de rand van de opheldering, dan minder geïnfecteerde cellen als je weg van het gebied van de clearing.
6. Om visualisatie van plaques te vergemakkelijken, overlay met 3 ml van 0,5% agarose (bereid als eerder beschreven) met 50 µg / ml neutraal rood. (Bereid neutraal rood (Sigma N7005) stockoplossing op 1 mg / ml in water of PBS. Filtreer steriliseren en op 4°C in het donker bewaren). Laat uitharden en incubeer de plaat een nacht bij 27°C. Neutraalrood zal gezonde cellen kleuren en de plaques zullen verschijnen als duidelijke gebieden, ongeveer 0,5 – 3 mm in diameter tegen een witte achtergrond. Aangezien neutraalrood een vitale kleurstof is, is het belangrijk te kleuren terwijl de celmonolayer gezond is, d.w.z. 4 tot 7 dagen na infectie.

Plaque Zuivering uit Virale Voorraad

Om een goede isolatie te verzekeren, is het best dat plaques worden geplukt van platen die minder dan 50 plaques bevatten. Plaat verschillende verdunningen van het virus om ervoor te zorgen dat een voldoende laag aantal plaques wordt verkregen. Plaques kunnen worden opgepikt met behulp van steriele micropipet tips (1.000 µl) of microcapillaire buisjes.

Virus van plaque pickup

1. Markeer de plaat onder de plaque met een marker. Met behulp van een steriele pipetpunt, verwijder een agarose plug direct boven de plaque. Pluk op deze manier tussen de 10 en 100 plaques.
2. Plaats elke agaroseplug in een aparte microcentrifugebuis met 1 ml weefselkweekmedium. Eluteer de virusdeeltjes uit de agarose door de buis een nacht te laten draaien bij 4°C.
3. Voeg 200 µl van elke plaqueplug toe aan afzonderlijke putjes van een weefselkweekplaat met 12 putjes, gezaaid met 2 x 10 5 cellen per putje in 1 ml vers TNM-FH-medium. Incubeer de platen gedurende 3 dagen bij 27°C.
4. Het virussupernatant van deze stock van passage-één kan worden verzameld en gedurende 5 min bij 1.000 xg bij 4°C worden gecentrifugeerd om debris te verwijderen. Bewaar bij 4°C.
5. Zaai een 100 mm weefselkweekplaat met 5 x 10 6 cellen voor elk plaque-isolaat. Laat cellen hechten en vervang medium door 10 ml verse TNM-FH media.
6. Voeg 200 µl van de passage-one stock toe aan de 100 mm plaat en incubeer bij 27°C gedurende 4 dagen. Bewaar de resterende 800 µl passage-one stock bij 4°C als backup.
7. Oogst het virale supernatant en centrifugeer om debris te verwijderen. Bepaal de titer van deze passage-twee bouillon. Als de titer onder 2 x 10 8 pfu/ml blijft, ga dan verder met Baculovirus Amplification.