Van ’t Hoff verwierf zijn vroegste reputatie op het gebied van de organische chemie. In 1874 verklaarde hij het verschijnsel van optische activiteit door aan te nemen dat de chemische bindingen tussen koolstofatomen en hun buren gericht waren naar de hoeken van een regelmatig tetraëder. Deze driedimensionale structuur verklaart de isomeren die in de natuur worden aangetroffen. Hij deelt de eer hiervoor met de Franse chemicus Joseph Le Bel, die onafhankelijk van hem op hetzelfde idee kwam.
Drie maanden voordat hij promoveerde publiceerde Van ’t Hoff deze theorie, die tegenwoordig wordt beschouwd als de basis van de stereochemie, eerst in een Nederlands pamflet in de herfst van 1874, en vervolgens in mei daaropvolgend in een klein Frans boekje getiteld La chimie dans l’espace. Een Duitse vertaling verscheen in 1877, in een tijd dat Van ’t Hoff alleen een baan kon vinden aan de diergeneeskundige school in Utrecht. In deze beginjaren werd zijn theorie grotendeels genegeerd door de wetenschappelijke gemeenschap, en scherp bekritiseerd door een vooraanstaand chemicus, Hermann Kolbe. Kolbe schreef:
“Ene Dr. J. H. van ’t Hoff van de Diergeneeskundige School te Utrecht heeft blijkbaar geen voorliefde voor exact chemisch onderzoek. Hij heeft het handiger gevonden om op Pegasus te klimmen (kennelijk geleend van de Veterinaire School) en in zijn ‘La chimie dans l’espace’ te verkondigen hoe, in zijn stoutmoedige vlucht naar de top van de chemische Parnassus, de atomen hem in de kosmische ruimte gerangschikt leken.”
Rond 1880 kwam er echter erkenning voor Van ’t Hoffs theorie door belangrijke chemici als Johannes Wislicenus en Viktor Meyer.
In 1884 publiceerde Van ’t Hoff zijn onderzoek naar chemische kinetiek, getiteld Études de Dynamique chimique (“Studies in Chemische Dynamiek”), waarin hij een nieuwe methode beschreef om de volgorde van een reactie te bepalen met behulp van grafieken en de wetten van de thermodynamica toepaste op chemische evenwichten. Hij introduceerde ook het moderne concept van chemische affiniteit. In 1886 toonde hij een overeenkomst aan tussen het gedrag van verdunde oplossingen en gassen. In 1887 richtte hij samen met de Duitse chemicus Wilhelm Ostwald een invloedrijk wetenschappelijk tijdschrift op onder de naam Zeitschrift für physikalische Chemie (“Tijdschrift voor fysische chemie”). Hij werkte aan de theorie van Svante Arrhenius over de dissociatie van elektrolyten en gaf in 1889 een fysische rechtvaardiging voor de Arrhenius-vergelijking. In 1896 werd hij professor aan de Pruisische Academie van Wetenschappen in Berlijn. Zijn studies van de zoutafzettingen bij Stassfurt vormden een belangrijke bijdrage aan de Pruisische chemische industrie.
Van ’t Hoff werd docent scheikunde en natuurkunde aan de Diergeneeskundige Hogeschool in Utrecht. Daarna werkte hij bijna 18 jaar als hoogleraar in de scheikunde, mineralogie en geologie aan de Universiteit van Amsterdam en werd uiteindelijk voorzitter van de afdeling scheikunde. In 1896 verhuisde Van ’t Hoff naar Duitsland, waar hij in 1911 zijn loopbaan afsloot aan de Universiteit van Berlijn. In 1901 ontving hij de eerste Nobelprijs voor de Scheikunde voor zijn werk met oplossingen. Zijn werk toonde aan dat zeer verdunde oplossingen wiskundige wetten volgen die sterk lijken op de wetten die het gedrag van gassen beschrijven.