Immunohistochemie (IHC) is een krachtige, op microscopie gebaseerde techniek voor het visualiseren van cellulaire componenten, bijvoorbeeld eiwitten of andere macromoleculen in weefselmonsters. De kracht van IHC is de intuïtieve visuele output die het bestaan en de lokalisatie van het doelwit-eiwit onthult in de context van verschillende celtypes, biologische toestanden, en/of subcellulaire lokalisatie binnen complexe weefsels.
De IHC techniek werd uitgevonden in de jaren 1940 (Coons, Creech, & Jones, 1941) en wordt routinematig gebruikt als een belangrijk instrument in de gezondheidszorg en pathologie voor bijvoorbeeld diagnostische doeleinden of om patiënten te stratificeren voor geoptimaliseerde behandelingsregimes. IHC wordt ook veel gebruikt in onderzoek waarbij interessante moleculen worden geanalyseerd om hun rol in zowel gezonde als zieke cellen en weefsels op moleculair, cellulair of weefselniveau te bestuderen. Er zijn veel verschillende manieren om targets in weefsels te visualiseren met behulp van IHC of op IHC gebaseerde methoden, en er bestaan talrijke protocollen voor verschillende toepassingen en assays. Hoewel IHC over het algemeen een robuuste en gevestigde methode is, moeten nieuwe assays vaak zorgvuldig worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het weefsel of van de eigenschappen van het doeleiwit, de bindmiddel-molecule en/of het reporter-systeem. Vele jaren van technische ontwikkeling en de enorm toegenomen beschikbaarheid van specifieke bindmoleculen hebben de bruikbaarheid en het toepassingsgebied van IHC sterk verbeterd. De vooruitgang op het gebied van op IHC gebaseerde technieken en reagentia heeft wetenschappers en zorgverleners in staat gesteld preciezere instrumenten, assays en biomarkers te gebruiken. Bovendien heeft de technische vooruitgang bijvoorbeeld zeer gevoelige gelijktijdige detectie van meerdere eiwitten in hetzelfde monster en de detectie van eiwit-eiwitinteracties mogelijk gemaakt (zie Proximity Ligation Assay).
De klassieke IHC-test wordt geïllustreerd in figuur 1 en omvat de detectie van epitopen die tot expressie worden gebracht door één eiwit-doelwit in een weefselmonster met behulp van een “primair antilichaam” dat in staat is die epitopen met hoge specificiteit te binden. Na de binding van het epitoop-antilichaam wordt een “secundair antilichaam” toegevoegd dat in staat is het primaire antilichaam met hoge specificiteit te binden. Het secundaire antilichaam is gekoppeld aan een reportermolecuul en na de binding van het antilichaam-antilichaam wordt een chemisch substraat toegevoegd dat reageert met het reportermolecuul om een gekleurd neerslag te produceren op de plaats van het gehele epitoop-antilichaamcomplex.
Figuur 1. Het basisprincipe van immunohistochemie.
In de schematische illustratie (figuur 1) wordt een formaline-vaste, in paraffine ingebedde weefselsectie gekleurd met een primair antilichaam gericht tegen een specifiek eiwitdoelwit. Een oplossing die het primaire antilichaam bevat, wordt aan het weefselgedeelte toegevoegd en de antilichamen krijgen enige tijd om hun doelwit te vinden en zich daaraan te binden. Na deze stap worden ongebonden en overtollige antilichamen weggespoeld en wordt het secundaire antilichaam toegevoegd. Het secundaire antilichaam, dat een linkermolecuul met mierikswortelperoxidase (HRP)-enzymen bevat, krijgt ook enige tijd om zich aan het primaire antilichaam te binden, gevolgd door nog een wasstap. Daarna wordt 3,3′ diaminobenzidine (DAB) toegevoegd. Het HRP-enzym zet het DAB-substraat om in een bruinachtig neerslag dat in het weefsel wordt afgezet op de plaats van de reactie, waardoor een visuele voorstelling ontstaat van de plaats waar het primaire antilichaam het eerst zijn doelwit heeft gebonden.
Technologie
Weefselvoorbereiding
Het weefsel speelt een centrale rol in het experiment en het is belangrijk dat het zo wordt bewerkt dat epitopen en de juiste morfologie bewaard blijven. De meest gebruikelijke bewerking voor IHC is de voorbereiding van formaline-ingevulde paraffine-ingebedde (FFPE) weefselblokken. Het doel van formalinefixatie is om chemische cross-linking van eiwitten in het weefsel tot stand te brengen. Hierdoor worden alle cellulaire processen beëindigd en worden de cellulaire componenten bevroren op de plaats en in de conformatie waarin zij zich bevonden op het ogenblik van de fixatie en wordt tevens degradatie voorkomen. Na adequate fixatie wordt het weefsel verder verwerkt en uiteindelijk ingebed in paraffineblokken, die vervolgens met behulp van een microtoom in dunne plakjes (gewoonlijk 4-10 µm) worden gesneden. De coupes worden op glasplaatjes overgebracht en vóór de verdere verwerking laten hechten.
Na formaline worden soms nog andere fixatiemethoden gebruikt. Deze omvatten andere soorten aldehyden of het gebruik van verschillende alcoholoplossingen. De beste keuze van het fixeermiddel hangt sterk af van het onderzoek. Een gebruikelijk alternatief voor FFPE is de bereiding van ingevroren weefselmonsters. In dat geval wordt het weefsel ingebed in een cryoprotectief medium en ingevroren, en wordt de fixatie na de doorsnede uitgevoerd. Bevroren weefsels worden in cryostaten gesneden en hebben het voordeel van korte verwerkingstijden en van betere bewaring van gevoelige epitopen, maar kunnen vaak inferieur zijn aan FFPE-weefsels in termen van bewaring van histologische morfologie.
Antigeen (epitoop) retrieval
Een punt van zorg in verband met cross-linking fixatieven zoals formaline, of een te lange tijd doorgebracht in fixatief medium is de maskering van epitopen, die het primaire antilichaam kan belemmeren bij het binden aan zijn doelwit. Vooral bij FFPE-monsters moet vaak een deel van de chemische verknoping worden teruggedraaid en moeten de epitopen worden “teruggehaald” voordat tot de eigenlijke IHC wordt overgegaan. Er zijn verschillende protocollen voor het terughalen van antigenen beschikbaar en de voornaamste strategieën omvatten behandeling van het weefseldia met hitte, spijsverteringsenzymen, detergenten, of combinaties daarvan. De meest gebruikelijke methode voor het terugwinnen van antigeen in FFPE-monsters is het onder druk koken van de weefseldia’s in een zure citraatbuffer gedurende ongeveer 15-20 minuten.
Antilichaambinding
De kwaliteit en specificiteit van het bindingsmolecuul is van cruciaal belang voor elke IHC-gebaseerde techniek, en de keuze van het bindmiddel kan rechtstreeks van invloed zijn op het resultaat, de betrouwbaarheid en eventueel ook de interpretatie van de assay. Antilichamen zijn veruit het meest gebruikte type bindmolecule voor IHC, en hoewel de meeste antilichamen in staat zijn de juiste interessante molecule op adequate wijze te detecteren, kunnen zij ook sterk verschillen in hun specificiteit voor het beoogde doelwit. Antilichamen met een hoge specificiteit zijn daarom betrouwbaarder bij de interpretatie van “on-target”-binding, aangezien zij weinig of geen “off-target”-binding of “achtergrond” produceren. Antilichamen die minder specifiek zijn, kunnen meer “off-target”-binding produceren, en de resulterende achtergrond zal mogelijk de correcte interpretatie van de echte “on-target”-signalen verstoren. Er zijn twee hoofdtypes antilichamen: polyklonale antilichamen, d.w.z. een heterogene mix van antilichamen die verschillende epitopen op het doelwit binden, en monoklonale antilichamen die allemaal hetzelfde epitoop binden. Polyklonale antilichamen zijn vaak zeer krachtig omdat zij in staat zijn meerdere epitopen op hetzelfde doelwit op te sporen en te binden. De epitopen die zij binden zijn echter vaak slecht gedefinieerd en met meervoudige en variërende epitoopspecificiteiten neemt de kans op bindingsincidenten buiten het doelgebied en achtergrondruis toe. De potentie van polyklonale antilichamen kan echter een voordeel zijn omdat de concentratie van bindingsgebeurtenissen rond het doelmolecuul gewoonlijk groter is dan de potentiële achtergrondruis. Een nadeel is dat polyklonale antilichamen gewoonlijk een beperkte hulpbron zijn omdat zij worden afgeleid van dierlijke sera. Monoklonale antilichamen daarentegen hebben meer continuïteit aangezien zij kunnen worden geproduceerd in hybridoma cellijnen. Monoklonale antilichamen zijn ook vaak goed gedefinieerd in termen van epitoopbinding, maar kunnen nog steeds resultaten genereren die moeilijk te interpreteren zijn als de specificiteit laag is of als het doel-epitoop in geringe overvloed aanwezig is.
Zorgvuldige optimalisatie en titratie van antilichaamconcentratie voor elke assay is nodig, omdat het resultaat niet alleen afhankelijk is van de specificiteit en affiniteit van het antilichaam voor het doel, maar ook van de concentratie en beschikbaarheid van on-target en potentiële off-target epitopen aanwezig in het monster. Door te veel antilichamen aan het monster toe te voegen, zal het aantal mogelijke off-target bindingsgebeurtenissen met lage affiniteit toenemen zodra de on-target epitoop(en) verzadigd zijn met binders. Door de antilichaamconcentratie te verlagen, worden off-target bindingsgebeurtenissen zeldzamer, aangezien ze gewoonlijk een lagere affiniteit hebben dan on-target bindingsgebeurtenissen. Het risico bij pogingen om de achtergrond te verminderen terwijl een antilichaam met lage affiniteit wordt gebruikt, is dat de on-targetsignalen tegelijkertijd worden verzwakt tot het punt dat een vals-negatief resultaat wordt verkregen.
Andere soorten bindmoleculen die soms in IHC-gebaseerde technieken worden gebruikt, zijn affibodies, peptiden, antilichaamfragmenten of andere kleine moleculen.
Detectiesystemen
Het hele doel van het uitvoeren van IHC is het verkrijgen van een visuele voorstelling van waar het doelwit binnen het experimentele weefsel kan worden gevonden, en bij voorkeur ook het verkrijgen van informatie over het expressiepatroon van het doelwit onder heterogene celpopulaties en/of subcellulaire lokalisaties. Dit wordt geïllustreerd in figuur 2, die illustreert hoe verschillende antilichamen worden gebruikt om verschillende cellulaire of weefselcompartimenten binnen een complex weefsel te visualiseren. Om de interactie tussen doelwit en antilichaam te visualiseren is een detectiesysteem nodig dat een waarneembare vlek of signaal produceert. De meest gebruikelijke methode om een detectiesysteem in het experiment in te brengen is het gebruik van een secundair antilichaam dat een vooraf gebonden reportermolecule bevat, d.w.z. een enzym of een fluorofoor. Secundaire antilichamen zijn gewoonlijk specifiek gericht tegen antilichaammoleculen van een andere diersoort. Bijvoorbeeld, als het primaire antilichaam in een konijn wordt opgewekt, dan moet het secundaire antilichaam in een ander dier worden opgewekt en specifiek gericht zijn tegen konijnenantilichamen.
| Esophagus | Magnification | ||
|---|---|---|---|
| Hematoxylinekleuring | geen kleuring met antilichamen | ||
| TP63 CAB000083 |
nucleaire kleuring | ||
| EGFR CAB000035 |
Membraneuze kleuring | ||
| G6PD HPA000247 |
Cytoplasmatische kleuring | ||
| LAMB2 (Laminine) CAB000053 |
Connectief weefsel |
Figuur 2. Visualisatie van verschillende eiwit targets in complexe weefsels. De rechter kolom toont een vergroting van de overeenkomstige beelden in de linker kolom.
In de IHC beeld (figuur 2), opeenvolgende secties van de menselijke slokdarm gekleurd met vier verschillende antilichamen maakt een directe vergelijking van verschillende eiwitexpressie patronen binnen het weefsel en binnen subcellulaire compartimenten. De bovenste beelden zijn alleen tegengekleurd voor hematoxyline ter vergelijking. De p63 antilichaam vlekken celkernen in een populatie van cellen die zich in het basale deel van de slokdarm epitheel. Het EGFR (Epidermal growth factor receptor) antilichaam lijkt dezelfde celpopulatie te kleuren als p63, maar kleurt celmembranen in plaats van kernen. Het G6PD-antilichaam (Glucose-6-fosfaatdehydrogenase) kleurt het cytoplasma van een breder repertoire van slokdarmepitheelcellen en ook cellen die zich in het bindweefsel bevinden. Het laminine (LAMB2) antilichaam kleurt alleen cellen en structuren in het bindweefsel dat aan de slokdarm ten grondslag ligt.
Voor FFPE weefselmonsters is de meest gebruikelijke detectiemethode het gebruik van enzymatische reacties om een gekleurd precipitaat te genereren op de plaats waar het antilichaam wordt gebonden. De secundaire antilichamen dragen dan een enzym, b.v. mierikswortelperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP), dat in staat is chromogenen zoals 3,3′ diaminobenzidine (DAB) of 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat/ p-nitroblue tetrazoliumchloride (BCIP/NBT) om te zetten in bruine of blauwachtige precipitaten die in het weefsel op de plaats van de reactie worden afgezet. Chromogene kleurstoffen zijn waarneembaar in lichtmicroscopie en zijn gewoonlijk zeer stabiel gedurende lange perioden, wat gunstig is als het experiment moet worden gearchiveerd of op een later tijdstip moet worden herzien.
Voor bevroren weefselcoupes is het gebruikelijker om aan fluoroforen gekoppelde secundaire antilichamen te gebruiken die een specifieke kleur (gewoonlijk groen, rood of blauw) uitstralen wanneer zij door de juiste golflengten van licht worden geëxciteerd. Bovendien zijn fluoroforen gewoonlijk niet stabiel gedurende lange perioden. Het voordeel van het gebruik van fluoroforen is echter dat zij een gemakkelijke methode bieden voor het uitvoeren van dubbel-labelingexperimenten waarbij verschillende antilichamen tegen verschillende doelwitten in hetzelfde monster worden onderzocht. De secundaire antilichamen moeten gericht zijn tegen verschillende primaire antilichamen en ook gekoppeld worden aan verschillende fluoroforen. De verschillende secundaire antilichamen worden vervolgens afzonderlijk waargenomen door ze achtereenvolgens met verschillende golflengten licht op te wekken. Deze verschillende excitatieresultaten worden als afzonderlijke beelden (of kleurkanalen) opgeslagen en kunnen later over elkaar worden gelegd om co-lokalisaties van proteïnen enz. af te leiden.
Het gebruik van reporter-dragende secundaire antilichamen voor detectie is op zichzelf al een versterkingsstap, aangezien verschillende secundaire antilichamen in staat zijn één enkel primair antilichaam te binden, maar soms zijn verdere versterkingsstappen gewenst om het signaal en de gevoeligheid van het experiment te verhogen. In dergelijke gevallen kan het secundaire antilichaam in plaats daarvan “linkermoleculen” bevatten, bijvoorbeeld biotinepolymeren, die in staat zijn een groter aantal reportermoleculen in de volgende stappen te rekruteren. Deze strategie voor het versterken van signalen is nuttig voor zowel enzymatische als fluorescente detectiemethoden.
Kleuring met tegenkleuring
Immunohistochemische kleuring met chromogenen heeft vaak baat bij de toepassing van een tegenkleuring die het contrast verhoogt en de waarneming van histologische kenmerken vergemakkelijkt. Het meest gebruikte type tegenkleuring voor FFPE monsters is hematoxyline dat het cytoplasma van de cellen lichtblauw kleurt, en de celkernen donkerder blauwachtig kleurt. Fluorescente kleuringen worden gewoonlijk niet met hematoxyline tegengekleurd, aangezien de detectiemethode niet op lichtmicroscopie is gebaseerd. In plaats daarvan is de meest gebruikelijke manier om tegenkleuring voor fluorescentie te verkrijgen het labelen van celkernen door toevoeging van fluorescerende kleurstoffen die nucleïnezuren binden. Na de eigenlijke immunohistochemische reactie zijn de enige resterende stappen het afdekken en verzegelen van het monster voor bescherming en langdurige opslag. De meest gebruikelijke manier is het “vastlijmen” van het dekglaasje op het monster met behulp van in de handel verkrijgbare, speciaal voor dit doel vervaardigde harsen.
Specifieke voorbeelden
IHC wordt veel gebruikt, zowel in het onderzoek als in de klinische praktijk. Het Human Protein Atlas (HPA) project is een uitstekend voorbeeld van hoe high-throughput IHC wordt gebruikt om op grote schaal het menselijk proteoom in kaart te brengen in een veelheid van weefsels, kankers en cellen. In het HPA-project vergemakkelijkt een gestroomlijnde interne grootschalige antilichamenproductieketen de productie van specifieke antilichamen, die na het doorlopen van basiskarakteriserings- en validatieregimes worden gebruikt voor het systematisch kleuren van weefselmicroarrays met honderden weefselkernen binnen één enkel experiment. Het door HPA toegepaste IHC-systeem steunt in hoge mate op standaardisatie van protocollen en automatisering met behulp van machines, maar de evaluatie van de optimale titratie voor elk antilichaam wordt handmatig uitgevoerd voordat het antilichaam wordt goedgekeurd voor kleuring op de volledige reeks weefsels. Elke gekleurde weefselkern wordt geannoteerd met betrekking tot de immunohistochemische kleuring in weefsels en celtypen, en vervolgens als hoge-resolutiebeeld gepubliceerd op het webportaal dat door iedereen vrij kan worden bekeken.
In de klinische praktijk wordt IHC voornamelijk gebruikt binnen de pathologie om artsen te helpen bij de beoordeling van weefselmonsters met betrekking tot gezonde en of zieke toestanden, om diagnoses te stellen, en om het moleculaire subtype van verschillende soorten kanker te definiëren. Een specifiek voorbeeld van diagnostisch gebruik van IHC is het geval waarin pathologen een metastatisch tumormonster voorgelegd krijgen en de weefseloorsprong van de primaire tumor onbekend is. In deze gevallen gebruiken pathologen een panel van verschillende antilichamen die zich richten op weefselspecifieke eiwitten, zoals prostaat-specifiek antigeen voor prostaatkanker, of oestrogeenreceptor voor gynaecologische kankers, of cytokeratine 20 voor gastro-intestinale kankers (Gremel et al., 2014). Zodra een brede classificatie is gemaakt, worden aanvullende weefselspecifieke antilichamen gebruikt om de oorsprong van de primaire tumor verder te bepalen. Deze informatie is nuttig voor het kiezen van de beste of meest geschikte strategie voor medicamenteuze therapie en/of voor het lokaliseren van de primaire tumor voor bestralingstherapie en/of chirurgie.
Referenties en links
Gewoonlijk gebruikte antilichamen voor kankerdiagnostiek:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopathologie. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
Een review over het valideren van antilichamen voor IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – Een open-access database van publiek beschikbare antilichamen en hun bruikbaarheid in verschillende toepassingen:
IHC world – Protocols, Forum, Products, and more:
Een YouTube-clip ter illustratie van IHC van BioGenexLaboratories: