Immunoassay screening van difenhydramine (Benadryl®) in urine en bloed Using a Newly Developed Assay

Chemische structuren van antihistaminica.

Chemische structuren van antihistaminica.

Traditionele methoden voor het testen op DPH in menselijk plasma omvatten dure en tijdrovende monsterextractie gevolgd door bevestigingsprocedures. Verschillende groepen hebben melding gemaakt van het gebruik van verschillende gaschromatografische (GC) methoden voor het opsporen van DPH in plasma en urine (23-27). Er zijn ook rapporten over capillaire elektroforese (28) en vloeistofchromatografie-massaspectrometrische (LC-MS) methoden (29) die zijn ontwikkeld voor het opsporen van DPH. Tot nu toe zijn er in de literatuur geen rapporten verschenen over screening op difenhydramine met behulp van ELISA of een andere immunoassaymethode. In deze publicatie rapporteren wij over de eerste ELISA screening methode voor DPH in menselijke urine en bloed.

Het wordt beschouwd als standaard praktijk in toxicologie laboratoria om een immunoassay screening uit te voeren, waarbij positieve monsters eerst worden geïdentificeerd en verder worden bevestigd door GC-MS of LC-MS technieken. Dit wordt door de meeste toxicologielaboratoria toegepast als een “kosten-baten”-strategie, in tegenstelling tot het uitvoeren van een duurdere confirmatieprocedure op elk ontvangen specimen. Daarom zou een betrouwbare ELISA-screeningmethode voor toepassing op DPH-specimens in verband met verkeersongevallen en verkeersdoden nuttig zijn. Met dit doel voor ogen hebben toxicologen aanbevelingen gedaan voor DUID, waaronder een voorgestelde DPH cutoff van 25 ng/mL in bloed en 50 ng/mL in urine (30). Dit artikel beschrijft een robuuste en nauwkeurige ELISA screening methode voor DPH in menselijke urine en bloed volgens deze voorgestelde richtlijnen.

Experimenteel

Materialen

Reagenten en chemicaliën. Diphenhydramine werd verkregen van Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), en diphenhydramine-d3 (100 μg/mL oplossing in methanol) werd verkregen van Cerilliant (Round Rock, TX). DPH specifiek polyklonaal antilichaam werd opgewekt door Immunalysis (Pomona, CA), en DPH haptens en mierikswortelperoxidase-gelabelde conjugaten werden gesynthetiseerd bij Immunalysis. Het substraatreagens 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) dat voor de colorimetrische reactie werd gebruikt, werd verkregen van Pierce (Rockford, IL). De bij het proces gebruikte enzymen waren boviene thyroglobuline (BTG) verkregen van Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), mierikswortelperoxidase (HRP) verkregen van BBI Enzymes (Madison, WI), en boviene serumalbumine (BSA) verkregen van Proliant Biologicals (Boone, IA). Alle gebruikte oplosmiddelen waren HPLC-kwaliteit en alle chemicaliën waren ACS-kwaliteit en werden verkregen van Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Voor de ELISA werden de hoge kalibratiemiddelen voor DPH op 1000 ng/mL bereid in synthetische negatieve urine en synthetisch negatief bloed en bij 4°C bewaard. De synthetisch negatieve urine en het synthetisch negatieve bloed die in deze bepaling zijn gebruikt, zijn samengesteld met ingrediënten die in die respectieve matrices voorkomen en kwamen overeen met de immunoassayresponsen van drie negatieve menselijke urine- en bloedmonsters (31, 32). Synthetische negatieve urine bestaat uit een 0,1% BSA oplossing in gedeïoniseerd water; met 0,2% FD&C gele #6 kleurstof, en synthetisch negatief bloed bestaat uit een gepatenteerde Immunalysis formulering.

Apparatuur. HiTrap proteïne G HP affiniteitskolommen die werden gebruikt voor de zuivering van immunoglobuline G (IgG) werden aangekocht bij GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Standaard polystyreen microtiterplaten (96 wells) werden verkregen van Corning Costar (Corning, NY). Een Tecan Columbus Pro microtiterplaatwasmachine en Tecan Sunrise plaatlezer werden beide verkregen van Tecan (San Jose, CA). De pipetten die tijdens het ontwikkelingsproces van de immunoassay werden gebruikt, waren alle afkomstig van Rainin Instruments (Oakland, CA). Een 6410 triple-quadrupool MS en de Zorbax Eclipse XDB C18-kolom die voor LC-MS-MS-analyse werden gebruikt, werden beide aangekocht bij Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Methods

ELISA. De eerste stap in de ontwikkeling van de ELISA-methode betrof het genereren van polyklonale antilichamen die gebaseerd waren op de immunochemische reactie van een geselecteerde diersoort op een DPH-specifiek antigeen. Hiertoe werden konijnen eerst geïmmuniseerd met een DPH-antigeen bestaande uit DPH geconjugeerd aan boviene thyroglobuline (BTG). Het immunisatieproces en het uitbloeden van de konijnen werd uitbesteed aan een gespecialiseerde dierenfaciliteit. Het van de konijnen verkregen serum werd intern gezuiverd door affiniteitschromatografie door elutie over proteïne G kolommen, om de gezuiverde IgG fractie te verkrijgen. Het DPH-specifieke polyklonale IgG werd vervolgens geïmmobiliseerd op 96-wells polystyreen microtiterplaten. De overmaat antilichaam werd afgezogen, de vrije bindingsplaatsen van het antilichaam werden geblokkeerd met een 1% trehalose-oplossing in water en de platen werden vervolgens gedroogd in een vacuümoven bij 37°C gedurende een nacht. De platen werden verder bewaard in een verzegeld zakje met droogmiddel, aangezien het van cruciaal belang is ze vochtvrij te houden. Een DPH-urine-dosis-respons-curve werd eerst bereid door negatieve synthetische urine te verrijken met 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 en 500 ng/mL van de hoge ijkoplossing van het geneesmiddel. De bloedcurve werd verkregen door negatief synthetisch bloed te verrijken met 1, 5, 10, 25, 50, 100 en 250 ng/mL van de hoge ijkoplossing. Deze kalibratiemiddelen in synthetisch bloed werden vervolgens vóór de analyse verder verdund in een verhouding 1:10 met 100 mM fosfaatbuffer die 150 mM natriumchloride bevat (met fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,0). Alle bloedmonsters werden op dezelfde manier 1:10 verdund met fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,0). Urinemonsters werden eveneens 1:20 verdund met 100 mM gebufferde fosfaatzoutoplossing (pH 7,0). Kalibratiemiddelen en specimens werden vervolgens in duplo in de putjes van de microtiterplaat gepipetteerd, waarbij zowel voor urine als bloed een monstergrootte van 10 μl werd gebruikt. Dit werd gevolgd door toevoeging van 100 μl enzymconjugaat bestaande uit difenhydramine gelabeld met HRP. De plaat werd vervolgens gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. De putjes werden vervolgens zesmaal gewassen met 350 μL gedeïoniseerd water met behulp van een microtiterplaatwasmachine, afgezogen om water te verwijderen, vervolgens omgekeerd en drooggemept om eventueel resterend water uit de putjes te verwijderen. Het chromogene TMB-substraat (100 μL) werd vervolgens toegevoegd aan elk putje en de plaat geïncubeerd gedurende nog eens 30 minuten in het donker. De reactie werd vervolgens gestopt met 100 μl 1 N zoutzuur, om een gele kleur te produceren. De test is colorimetrisch en de extinctie werd afgelezen bij een dubbele golflengte van 450 nm en 650 nm met behulp van een microtiterplaatlezer. Bij de golflengte van 650 nm wordt de achtergrondabsorptie gemeten, die vervolgens door de plaatelezer van de uiteindelijke absorptie wordt afgetrokken. De intensiteit van de geproduceerde kleur is omgekeerd evenredig met de concentratie van de analyt in het monster.

LC-MS-MS. Voor de analyse werd gebruik gemaakt van een LC-pomp uit de 1200-serie, gekoppeld aan een 6410 triple-quadrupole MS die in positieve electrospray-ionisatie (ESI) werkte. De gebruikte LC-MS-MS-kolom was een Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). Het monster voor de analyse werd als volgt bereid: een urinemonster van 100 µL met 50 µL difenhydramine-d3 (200 ng/mL) werd aan een autosampler-flacon toegevoegd. De monsters werden via een autoinjector rechtstreeks in de LC-MS-MS geïnjecteerd. De kolomtemperatuur werd op 60 °C gehouden en het injectievolume bedroeg 5 µL. De mobiele fase bestond uit 0,2% azijnzuur pH 4 (oplosmiddel A) en methanol (oplosmiddel B). Aanvankelijk was de samenstelling van de mobiele fase 100% A bij een debiet van 0,7 ml/min over een periode van 6 min, daarna werd het percentage methanol verhoogd tot 100%, en na 7 min weer teruggebracht tot 100% A.

De gastemperatuur was 350°C, de gasstroom was 10 L/min, en de vernevelaarsdruk werd gehandhaafd op 50 psi. Als botsingsgas werd stikstof gebruikt en het capillairvoltage bedroeg 4000V. Voor elk geneesmiddel werden twee overgangen geselecteerd en geoptimaliseerd. De verblijftijd was 50 ms, en de optimale fragmentor-energie was 80 V voor alle overgangen. De optimale botsingsenergie-spanningen werden bepaald op 35V voor de gedutereerde interne standaard (difenhydramine-d3), 15V voor de primaire overgang, en 30V voor de secundaire overgang voor difenhydramine zelf. De verhouding tussen de kwalitatieve en de kwantitatieve overgang werd bepaald bij ongeveer het midden van het kalibratiebereik: 100 ng/mL. De overgang voor difenhydramine-d3 was 259,7 > 165,2; de primaire (kwantificerende) overgang voor difenhydramine was 256,7 > 167,2; de kwalificerende (secundaire) overgang 256,7 > 152,2. Ongelabeld difenhydramine kan zich van het precursorion afbreken in productionen van m/z 167 of 165, afhankelijk van de toegepaste botsingsenergie. Onze procedure is onder de beschreven omstandigheden gevalideerd. De aantoonbaarheidsgrens (LOD) van de LC-MS-MS-methode was 10 ng/mL en werd vastgesteld als de laagste concentratie die met een signaal/ruisverhouding > 2 aantoonbaar is.

Resultaten en Discussie

Dosis-respons-curve

De methode maakt gebruik van competitieve binding tussen het enzymconjugaat en de vrije analyt in het monster voor een vaste hoeveelheid antilichaambindingsplaatsen, evenredig met hun concentratie in het mengsel. De dosis-responskrommen voor DPH werden bereid in synthetische negatieve urine en synthetisch negatief bloed bij de eerder beschreven concentraties. B0 is de extinctie van de negatieve kalibrator, en B staat voor de extinctie van de afzonderlijke kalibratorniveaus. De procentuele verhouding van de individuele kalibrator tot de negatieve kalibrator (B/B0) werd voor elk kalibratorniveau berekend en uitgezet tegen de geneesmiddelconcentratie (ng/mL) voor zowel urine als bloed (figuur 3). De B/B0-waarden zijn omgekeerd evenredig met de drugconcentratie in het monster, omdat hoe hoger de drugconcentratie is, hoe minder drug-enzymconjugaat zich aan het antilichaam bindt, waardoor een lagere absorptiewaarde wordt verkregen.

LOD en cutoff

De LOD van de DPH-test werd bepaald als de laagste concentratie die nauwkeurig kan worden gemeten met behulp van de beschreven parameters voor de assay. Drie drugsvrije authentieke urinemonsters werden verrijkt met verschillende concentraties DPH tot 1 ng/mL en vervolgens in duplo geanalyseerd. De laagste waarde berekend uit twee standaarddeviaties werd verkregen en op basis van dit resultaat werd de LOD voor de bepaling bepaald op 1 ng/mL. De afkapconcentraties werden vastgesteld op 50 ng/mL voor urine en op 25 ng/mL voor bloed. Beide werden vastgesteld als de optimale beslissingspunten op basis van twee standaardafwijkingen van kalibratiemiddelen op het lineaire deel van de dosis-responscurve, en rekening houdend met aanbevolen richtlijnen die door de toxicologie zijn opgesteld.

Selectiviteit

Interferentie van verwante en niet-verwante verbindingen werd bestudeerd door deze stoffen in synthetische negatieve urine te spietsen en ze in de ELISA-test te laten lopen. Tabel I toont de kruisreactiviteit met de verbindingen die qua structuur en farmacologische activiteit nauw verwant zijn aan difenhydramine, en waarvan werd vastgesteld dat ze op of onder 1% lagen bij de assay cutoff van 50 ng/mL. Orphenadrine, dat zowel een spierverslapper als een antihistaminicum is, vertoonde een kruisreactie van 42% met de test omdat het een zeer vergelijkbare structuur heeft als DPH, zij het met één methylsubstituentgroep. Geen van de in figuur 2 afgebeelde metabolieten van DPH is bij deze test als kruisreagens gescreend omdat zij op dat moment niet in de handel verkrijgbaar waren.

Compounds die niet verwant waren met DPH werden ook geanalyseerd bij concentraties van 100.000 ng/mL in de assay. Tabel II toont de kruisreactiviteit met deze niet-verwante verbindingen. De meeste van deze verbindingen interfereerden niet met de detectie van DPH in de test. Vanwege overeenkomsten in de zijketenstructuur vertoonden verschillende verbindingen zoals amitriptyline, chloorpromazine, clomipramine, doxepine, imipramine en cyclobenzaprine een wisselende mate van kruisreactiviteit met de bepaling. Bevestigingsmethoden zouden bij voorkeur vals-positieven uitsluiten die door de ELISA worden gedetecteerd als gevolg van deze kruisreactanten die met de DPH-test zouden kunnen interfereren. Matrixeffecten van DPH-vrije authentieke urine- en bloedmonsters zijn ook bestudeerd om hun effect op de test te bepalen. Er werden geen ongewenste vals-positieve resultaten als gevolg van de urine- en bloedmatrices waargenomen toen met LC-MS-MS-bevestigde DPH-vrije urine- en bloedmonsters met de assay werden gescreend.

Precisie

ELISA intraday en interday precisies werden alleen uitgevoerd in synthetische urine bij concentraties van 0, 5, 10, 25, en 50 ng/mL. De intraday-precisie werd berekend als variatiecoëfficiënt (CV%) van 8 analyses uitgevoerd op dezelfde dag (n = 8) en bedroeg minder dan 10%, en de interday-precisie (CV%) werd berekend van 8 analyses per dag gedurende 10 dagen (n = 80) en bleek eveneens minder dan 10% te bedragen. De gegevens zijn weergegeven in tabel III.

Stabiliteit en houdbaarheid van assay

De houdbaarheid van een product kan worden gedefinieerd als de tijd dat de essentiële prestatiekenmerken onder specifieke behandelingsomstandigheden behouden blijven (33). Om aan deze eis voor klinische reagentia te voldoen, werd een versneld stabiliteitsonderzoek uitgevoerd om de houdbaarheid van het commerciële product bij benadering te bepalen. Het DPH-HRP-enzymconjugaat werd gedurende een periode van 14 dagen bij 37°C gestrest en gedurende die tijd met tussenpozen getest en de prestaties werden vergeleken met het gekoelde geneesmiddel-enzymconjugaat dat bij 4°C werd bewaard. De dosis/respons-curve werd gedurende de periode van 14 dagen bij ijkniveaus van 10, 50 en 100 ng/mL in synthetische urine uitgevoerd. De assay bleek een bijna identieke dosis-respons te vertonen gedurende de gehele versnelde tijdsstudie van 2 weken. Deze periode van 14 dagen versnelde tijdstests vertegenwoordigt het equivalent van ten minste 18 maanden stabiliteit in reële tijd bij 4°C (33). De gegevens zijn weergegeven in figuur 4.

Authentieke specimens

Teneinde de assay te valideren, werden gedurende een week op verschillende tijdstippen urinemonsters afgenomen van vijf vrijwilligers die regelmatig diphenhydramine voor therapeutische doeleinden gebruiken in verband met veel voorkomende allergiesymptomen. Alle vijf vrijwilligers werd gevraagd een vragenlijst in te vullen waarin alle medicijnen werden vermeld die zij gebruikten, en er werd opgemerkt dat geen andere medicijnen werden vermeld. Twintig monsters werden verzameld en eerst gescreend met behulp van ELISA en vervolgens bevestigd met LC-MS-MS. Alle urinemonsters werden 1:20 voorverdund met 100 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,0) alvorens de ELISA uit te voeren. Zes monsters bleken negatief te zijn bij beide methoden, terwijl 14 monsters positief waren bij ELISA, waarvan 1 monster negatief werd bevonden bij LC-MS-MS. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de hoeveelheid DPH in dat monster, zoals gevonden door LC-MS-MS, dicht bij de cutoff van 50 ng/mL lag. De positieve urinemonsters bleken DPH te bevatten tussen 60 en 700 ng/mL. Tien controle-urinemonsters werden ook bereid door synthetische negatieve urine te verrijken met lage en hoge positieve concentraties difenhydramine en verder geanalyseerd in de assay. De resultaten waren allemaal positief door ELISA en gecorreleerd met hun LC-MS-MS bevestigingsgegevens.

Postmortem specimens werden gebruikt voor validatie van de bloed assay. Twintig postmortale bloedmonsters werden verkregen van het LA County Coroner’s laboratorium. Alle bloedmonsters werden voor de analyse 1:10 voorverdund met 100 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,0). Alle 20 monsters werden positief bevonden door ELISA en werden vergeleken met hun GC-MS bevestigingsgegevens, ook verstrekt door het lijkschouwer lab, waaruit bleek dat ze een breed scala van DPH concentraties bevatten tussen < 100 en 870 ng/mL. Hoewel één specimen onder de GC-MS kwantificeringsgrens van 100 ng/mL bevestigde, werd DPH nog steeds geïdentificeerd met behulp van de ELISA procedure. Het doel van deze studie was de ELISA-methode te valideren met een bekende bevestigingsprocedure en niet te pogen concentraties te interpreteren. De conclusie van deze studie is dat de ELISA-test in staat is om therapeutische niveaus van DPH te detecteren, evenals veel hogere postmortale niveaus, en daarom gemakkelijk zou kunnen worden gebruikt voor DUID screening doeleinden, evenals voor gevallen van fataliteit.

Conclusies

DPH is een vrij verkrijgbare medicatie die in verband is gebracht met tal van rij-gerelateerde ongevallen, evenals met fataliteiten. Een ELISA-screen zou dus nuttig zijn om de aanwezigheid van vrij verkrijgbare medicatie zoals antihistaminica te bepalen in specimens die verkregen zijn in rij-gerelateerde situaties. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een zeer gevoelige en specifieke ELISA screening methode voor difenhydramine in zowel urine als bloed matrices met een precisie <10%. Voor zover de auteurs weten, is dit de eerste immunoassay-methode die is ontwikkeld voor de detectie van DPH in menselijke lichaamsvloeistoffen. Deze methode volgt de aanbevolen richtlijnen voor een cutoff van 50 ng/mL in urine en 25 ng/mL in bloed voor DUID gevallen. De geldigheid van de methode werd ook geverifieerd met authentieke urine- en bloedmonsters, en de ELISA-gegevens correleerden met de LC-MS-MS en GC-MS bevestigingsresultaten. Hoewel sommige van de geanalyseerde specimens afkomstig waren van postmortale gevallen, tonen de daarmee verkregen resultaten in combinatie met de lage LOD van de test duidelijk de toepasbaarheid van de test aan voor gevallen van verkeersongevallen, waarbij mogelijk lagere hoeveelheden DPH kunnen worden opgespoord. Er werd een zekere mate van kruisreactiviteit waargenomen met bepaalde tricyclische verbindingen die structureel vergelijkbaar zijn met DPH; eventuele vals-positieve resultaten ten gevolge van dergelijke verbindingen zouden echter in de bevestigingsfase worden geëlimineerd. Verdere studies moeten worden uitgevoerd om de kruisreactiviteit met de tricyclische verbindingen te elimineren en die met vergelijkbare antihistaminica te verbeteren.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door financiering van Immunalysis Corporation. Wij willen Dr. James Soares en Mr. Michael Vincent bedanken voor inzichtelijke discussies tijdens de voorbereiding van dit manuscript, Ms. Cynthia Coulter voor LC-MS-MS analyse van urinemonsters, en Mr. Dan Anderson van het LA County Coroner’s laboratorium voor het verstrekken van positieve bloedmonsters. We willen ook alle vrijwilligers bedanken die urinemonsters ter beschikking hebben gesteld.

,

,

,

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

,

,

,

,

,

,

.

,

,

, vol.

pg.

,

,

,

,

,

,

. ,

,

, vol.

8th ed

(pg.

–

)