Gertrude Stein werd geboren in Allegheny, Pennsylvania, op 3 februari 1874, als dochter van rijke Duits-joodse immigranten. Toen ze drie jaar oud was, verhuisde haar familie eerst naar Wenen en vervolgens naar Parijs. Ze keerden terug naar Amerika in 1878 en vestigden zich in Oakland, Californië. Haar moeder, Amelia, stierf in 1888 aan kanker en haar vader, Daniel, in 1891.
Stein bezocht van 1893 tot 1897 het Radcliffe College, waar ze zich specialiseerde in psychologie bij de bekende psycholoog William James. Na Radcliffe te hebben verlaten, schreef ze zich in aan de Johns Hopkins University, waar ze vier jaar medicijnen studeerde en in 1901 vertrok. In 1903 verhuisde Stein naar Parijs met Alice B. Toklas, een jongere vriendin uit San Francisco die haar hele leven haar partner en secretaresse zou blijven. Het paar keerde meer dan dertig jaar niet terug naar de Verenigde Staten. Tijdens de Eerste Wereldoorlog deden ze samen vrijwilligerswerk, waarbij ze voorraden naar ziekenhuizen in Frankrijk vervoerden.
Samen met Toklas en haar broer Leo, een kunstcriticus en schilder, nam Stein een appartement aan de Linkeroever. Hun huis, 27 rue de Fleurus, werd al snel een verzamelplaats voor veel jonge kunstenaars en schrijvers, waaronder Henri Matisse, Ezra Pound, Pablo Picasso, Max Jacob, en Guillaume Apollinaire.
Zij was een hartstochtelijk pleitbezorgster van het “nieuwe” in de kunst, haar literaire vriendschappen groeiden uit tot schrijvers zo divers als William Carlos Williams, Djuana Barnes, F. Scott Fitzgerald, James Joyce, en Ernest Hemingway. Het was voor Hemingway dat Stein de uitdrukking “de verloren generatie” bedacht om de uitgeweken schrijvers te beschrijven die tussen de oorlogen in het buitenland woonden.
In 1913 veroorzaakten Stein’s steun aan kubistische schilders en haar steeds avant-gardistischer schrijven een breuk met haar broer Leo, die naar Florence verhuisde. Haar eerste boek, Three Lives, werd gepubliceerd in 1909. Ze volgde het met Tender Buttons (Claire Marie) in 1914. Tender Buttons toonde duidelijk het diepgaande effect dat de moderne schilderkunst op haar schrijven had. In deze kleine prozagedichten komen beelden en zinnen op vaak verrassende manieren samen – vergelijkbaar met de kubistische schilderkunst. Haar schrijven, gekenmerkt door het gebruik van woorden voor hun associaties en klanken in plaats van hun betekenissen, kreeg veel belangstelling van andere kunstenaars en schrijvers, maar vond geen groot publiek.
Tot Stein’s meest invloedrijke werken behoren The Making of Americans (1925); How to Write (1931); The Autobiography of Alice B. Toklas (1933), dat een bestseller werd; en Stanzas in Meditation and Other Poems (1956). Sherwood Anderson schreef in de inleiding tot Geography and Plays (1922) dat haar schrijven “bestaat in een wederopbouw, en een geheel nieuwe herschepping van het leven, in de stad van woorden.”
Stein overleed in het American Hospital te Neuilly op 27 juli 1946, aan de gevolgen van ongeneeslijke kanker.