00:00:07.25Hi mijn naam is Jennifer Doudna van UC Berkeley
00:00:09.26en ik ben hier vandaag om u te vertellen over hoe we
00:00:12.26 een nieuwe genoom-engineering technologie hebben ontdekt.
00:00:15.07Dit verhaal begint met een bacterieel immuunsysteem
00:00:20.12Dat betekent begrijpen hoe bacteriën
00:00:22.14 een virale infectie afweren.
00:00:24.26Het blijkt dat veel bacteriën
00:00:28.04 in hun chromosoom hebben,
00:00:30.09wat is wat u hier ziet
00:00:32.15een opeenvolging van herhalingen die worden weergegeven in deze zwarte diamanten
00:00:36.18 die worden afgewisseld met reeksen
00:00:40.19 die afkomstig zijn van virussen
00:00:43.08en deze zijn opgemerkt door microbiologen
00:00:46.20die bezig waren met het sequencen van bacteriële genomen, maar niemand wist
00:00:50.10wat de functie van deze sequenties zou kunnen zijn
00:00:53.06tot men merkte dat ze meestal ook voorkomen
00:00:58.09met een reeks genen die vaak coderen voor eiwitten
00:01:03.29die homologie vertonen met enzymen die interessante dingen doen
00:01:09.03zoals DNA-reparatie.
00:01:10.12Dus was het een hypothese dat dit systeem
00:01:14.04 dat CRISPR ging heten
00:01:16.08 wat een acroniem is voor dit type repetitieve locus
00:01:19.14dat deze CRISPR systemen eigenlijk
00:01:22.29een verworven immuunsysteem in bacteriën
00:01:26.00waarmee sequenties van virussen kunnen worden geïntegreerd
00:01:29.06en dan later op de een of andere manier worden gebruikt
00:01:32.07om de cel te beschermen tegen een infectie
00:01:35.26met datzelfde virus.
00:01:37.05Dus dit was een interessante hypothese
00:01:39.11en we raakten betrokken bij het bestuderen hiervan
00:01:41.18in het midden van de jaren 2000 direct na de publicatie
00:01:44.15 van drie artikelen die wezen op de integratie van virale sequenties in deze genomische loci. En wat dus in de daaropvolgende jaren naar voren kwam, was dat deze CRISPR systemen.08 in feite verworven immuunsystemen zijn in bacteriën
00:02:01.18Dus tot op dat moment wist niemand dat bacteriën
00:02:04.24 zich zouden kunnen aanpassen
00:02:08.08 aan virussen die in de cel komen
00:02:10.29 maar dit is een manier waarop ze het doen
00:02:12.14 en het gaat om het detecteren van vreemd DNA
00:02:15.17dat wordt geïnjecteerd zoals in dit voorbeeld
00:02:18.04van een virus dat in de cel komt
00:02:20.07het CRISPR-systeem maakt integratie
00:02:26.06van korte stukjes van die virale DNA-moleculen
00:02:29.15in de CRISPR-locus
00:02:31.07en dan in de tweede stap
00:02:33.27die hier wordt weergegeven als CRISPR RNA biogenese
00:02:38.20worden deze CRISPR-sequenties feitelijk getranscribeerd
00:02:42.20in de cel tot stukjes RNA
00:02:45.15die vervolgens worden gebruikt samen
00:02:48.23met eiwitten die worden gecodeerd door de CAS-genen
00:02:52.09deze CRISPR-geassocieerde genen
00:02:54.01om interfererende of interferentiecomplexen
00:02:58.12te vormen die de informatie in de vorm
00:03:01.17van deze RNA-moleculen kunnen gebruiken om een basepaar
00:03:04.08te vormen met overeenkomende sequenties in viraal DNA.
00:03:07.18Dus een heel handige manier die bacteriën hebben bedacht om hun indringers te pakken
00:03:13.06 en de sequentie-informatie tegen hen te keren.
00:03:17.00Dus in mijn eigen laboratorium
00:03:20.21 zijn we al lange tijd zeer geïnteresseerd in het begrijpen hoe RNA-moleculen
00:03:26.03 worden gebruikt om cellen te helpen erachter te komen
00:03:32.00hoe de expressie van eiwitten
00:03:34.00 kan worden gereguleerd.03van het genoom.
00:03:35.05En zo leek dit ook een zeer interessant
00:03:37.27voorbeeld hiervan en
00:03:39.18we begonnen de fundamentele moleculaire mechanismen te bestuderen
00:03:42.24waarbij deze route werkt.
00:03:45.01En in 2011 ging ik naar een wetenschappelijke conferentie
00:03:49.23en ontmoette ik een collega van me,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier die op deze foto helemaal links te zien is
00:03:56.10en Emmanuelle’s lab
00:03:58.14 werkt aan microbiologische problemen en ze zijn vooral geïnteresseerd in bacteriën die menselijke ziekteverwekkers zijn.
00:04:04.01Zij bestudeerde een organisme genaamd
00:04:08.03Streptococcus pyogenes, een bacterie
00:04:11.15 die zeer ernstige infecties bij mensen kan veroorzaken
00:04:14.25en het merkwaardige aan dit insect was dat het een CRISPR-systeem had en in dat organisme
00:04:19.06was er een enkel gen dat codeerde voor een eiwit
00:04:21.27bekend als Cas9
00:04:23.12 waarvan genetisch was aangetoond dat het nodig was
00:04:26.09voor de functie van het CRISPR-systeem
00:04:28.16in Streptococcus pyogenes,
00:04:30.maar niemand wist op dat moment wat de functie van dat eiwit was. En dus kwamen we bij elkaar en rekruteerden mensen uit onze respectievelijke onderzoekslaboratoria om de functie van Cas9 te testen.
00:04:48.00in het midden staat Martin Jinek
00:04:50.03die een postdoctoraal medewerker is in mijn eigen lab
00:04:52.17en naast hem in het blauwe shirt
00:04:54.22is Kryztof Chylinski die een student was
00:04:57.20in Emmanuelle’s lab
00:04:58.26en zo zijn deze twee jongens samen met
00:05:00.21Ines Fonfara die helemaal rechts is,
00:05:02.10een postdoc bij Emmanuelle
00:05:04.01begonnen experimenten te doen aan de andere kant van de Atlantische Oceaan
00:05:07.25en hun gegevens te delen.
00:05:10.09En wat ze ontdekten was dat
00:05:13.06Cas9 eigenlijk een fascinerend eiwit is
00:05:16.04dat het vermogen heeft om te interageren met DNA en een dubbelstrengs breuk te genereren in DNA op sequenties die overeenkomen met de sequentie in een gids-RNA.08en wat u op deze dia ziet
00:05:29.06is dat het gids-RNA
00:05:30.10en de volgorde van de gids in oranje
00:05:32.11dat basenparen vormt met één streng
00:05:34.18van het dubbele spiraalvormige DNA
00:05:37.11en heel belangrijk dit RNA
00:05:39.28interageert met een tweede RNA molecuul
00:05:42.09 genaamd tracr dat een structuur vormt
00:05:46.03die het Cas9 eiwit werft
00:05:47.29dus deze twee RNA’s en een enkel eiwit
00:05:50.13in de natuur zijn wat nodig is
00:05:52.23voor dit eiwit om te herkennen
00:05:56.05wat normaal virale DNA’s zouden zijn
00:05:58.11 in de cel en het eiwit
00:06:01.13is in staat om deze op te knippen,
00:06:02.14letterlijk door de dubbele spiraal van DNA op te breken.
00:06:05.24En dus toen we dit uitzochten
00:06:08.14 dachten we: zou het niet geweldig zijn
00:06:10.26 als we eigenlijk een eenvoudiger systeem konden genereren
00:06:13.29ste wat de natuur heeft gedaan
00:06:15.02door deze twee RNA-moleculen aan elkaar te koppelen
00:06:18.04om een systeem te genereren dat zou bestaan uit één eiwit
00:06:20.16en één geleidend RNA.
00:06:22.28Dus het idee was om deze twee RNA’s die u aan de andere kant ziet
00:06:29.29 van de dia te nemen en ze dan in feite aan elkaar te koppelen
00:06:33.19om wat wij noemen
00:06:35.04een enkel geleidend RNA te creëren.
00:06:36.22Dus Martin Jinek in het lab
00:06:38.25maakte die constructie
00:06:40.21en we deden een heel eenvoudig experiment
00:06:44.22om te testen of we echt
00:06:46.18een programmeerbaar DNA-splitsend enzym hadden
00:06:49.29 en het idee was om korte enkelvoudige gids-RNA’s te genereren
00:06:54.04die verschillende plaatsen herkennen in een circulair DNA-molecuul
00:06:59.24dat u hier ziet
00:07:00.21en de gids-RNA’s waren ontworpen
00:07:03.10 om de sequenties te herkennen die door de rode balken worden weergegeven
00:07:06.17 op de dia en het experiment bestond er vervolgens uit
00:07:10.16 om die plasmide te nemen, die cirkelvormige DNA-molecule
00:07:13.21en deze te incuberen met twee verschillende restrictie (of knip)enzymen,
00:07:18.één genaamd SalI dat het DNA doorsnijdt
00:07:21.23het DNA zo’n beetje stroomopwaarts aan het uiteinde
00:07:25.05van het DNA in deze afbeelding
00:07:26.12in het grijze vakje,
00:07:27.19en de tweede plaats die wordt geleid
00:07:31.00door het RNA-geleide Cas9
00:07:33.13op deze verschillende plaatsen die in rood zijn weergegeven.
00:07:35.16En een heel eenvoudig experiment
00:07:37.19we deden deze incubatiereactie
00:07:39.26met plasmide DNA en dit is het resultaat
00:07:43.24en dus dit is waar je naar kijkt
00:07:45.28is een agarose gel
00:07:47.29die ons in staat stelt
00:07:49.16de gesplitste moleculen van DNA te scheiden
00:07:51.20en wat u kunt zien is dat in elk van deze reactiestroken
00:07:54.22we een DNA molecuul van verschillende grootte krijgen dat vrijkomt
00:07:58.12uit deze dubbel verteerde plasmide
00:08:00.16waarin de grootte van het DNA
00:08:03.29correspondeert met splitsing op de verschillende plaatsen
00:08:06.11gericht door deze gids RNA sequenties
00:08:08.26aangegeven in rood
00:08:10.24dus dit was een echt opwindend moment
00:08:12.29feitelijk een zeer eenvoudig experiment dat
00:08:15.15enkele van een “A ha!” moment
00:08:17.03waarop we zeiden dat we echt een programmeerbaar DNA-snij-enzym
00:08:22.02 hebben en dat we het kunnen programmeren met een kort stukje RNA
00:08:24.15om in wezen elke dubbelstrengs DNA-sequentie te splitsen
00:08:28.07 dus de reden waarom we zo enthousiast waren
00:08:30.23 over een enzym dat kan worden geprogrammeerd
00:08:33.19om dubbelstrengs DNA-onderbrekingen te genereren
00:08:36.01op elke willekeurige volgorde is omdat
00:08:39.00Er was een lange reeks experimenten
00:08:42.16in de wetenschappelijke gemeenschap die aantoonden
00:08:45.13dat cellen manieren hebben om dubbelstrengs DNA-breuken
00:08:49.26 te repareren die leiden tot veranderingen
00:08:52.02in de genomische informatie in het DNA
00:08:55.21dus dit is een dia die laat zien dat
00:08:58.20nadat een dubbelstrengs breuk is gegenereerd
00:09:01.14door elk soort enzym dat dit zou kunnen doen
00:09:04.13inclusief het Cas9 systeem
00:09:06.05die dubbelstrengs breuken in een cel
00:09:07worden gedetecteerd en gerepareerd door twee soorten routes
00:09:13.15een aan de linkerkant die
00:09:17.26non-homologe end joining
00:09:20.07 waarbij de uiteinden van het DNA chemisch aan elkaar worden geligeerd
00:09:24.07 meestal met introductie
00:09:26.18van een kleine insertie of deletie
00:09:28.25op de plaats van de breuk
00:09:29.27en aan de rechterkant
00:09:32.01is een andere manier waarop reparatie plaatsvindt
00:09:34.00door middel van homologie gerichte reparatie
00:09:37.22waarbij een donor DNA molecuul
00:09:39.14thdat sequenties heeft die overeenkomen met die
00:09:43.28flankerend met de plaats van de
00:09:45.12dubbele streng breuk kan
00:09:48.05worden geïntegreerd in het genoom op de plaats
00:09:50.10van de breuk om nieuwe genetische informatie
00:09:54.06in het genoom te introduceren
00:09:55.15Dus dit had veel wetenschappers op het idee gebracht dat als er een hulpmiddel zou zijn of een technologie die wetenschappers of onderzoekers in staat zou stellen om dubbelstrengsbreuken te introduceren op gerichte plaatsen
00:10:09.00in het DNA van een cel te introduceren, dan weten we samen met alle genoomsequentiegegevens
00:10:14.21die nu beschikbaar zijn, de
00:10:16.10gehele genetische sequentie van een cel
00:10:18.21 en als je wist waar een mutatie optrad
00:10:21.20 die bijvoorbeeld een ziekte veroorzaakt
00:10:23.20 zou je een technologie als deze
00:10:26.25 daadwerkelijk kunnen gebruiken om DNA in te brengen dat een mutatie zou herstellen
00:10:31.00of een mutatie genereren
00:10:32.23die je zou willen bestuderen in een onderzoekssetting
00:10:35.04dus de kracht van deze technologie is
00:10:38.28eigenlijk het idee dat we nu
00:10:41.20dit soort dubbelstrengs breuken kunnen genereren
00:10:43.17op plaatsen die wij als wetenschappers kiezen
00:10:46.17door Cas9 te programmeren en dan de cel toe te staan
00:10:48.13reparaties uit te voeren die
00:10:51.04genomische veranderingen introduceren op plaatsen van deze breuken
00:10:54.15maar de uitdaging was hoe de breuken te genereren
00:10:58.11in de eerste plaats en dus waren er een aantal
00:11:00.09verschillende strategieën
00:11:03.24geproduceerd om dit in verschillende laboratoria te doen
00:11:05.De meeste van hen, en ik ga hier twee specifieke voorbeelden laten zien
00:11:08.21 één genaamd zinkvingernucleasen
00:11:12.25en de andere TAL-effectordomeinen
00:11:15.02het zijn beide programmeerbare manieren
00:11:18.08om dubbelstrengsbreuken in DNA te genereren
00:11:20.21die zullen berusten op eiwitgebaseerde herkenning
00:11:23.29van DNA-sequenties, dus dit zijn eiwitten
00:11:26.06die modulair zijn, en kunnen worden gegenereerd
00:11:29.12in verschillende combinaties van modules
00:11:31.22om verschillende DNA-sequenties te herkennen
00:11:34.03het werkt als een technologie
00:11:37.18maar het vereist veel eiwit engineering
00:11:40.24om dit te doen, en wat echt spannend is
00:11:43.16van dit CRISPR/Cas9 enzym
00:11:46.11is dat het een RNA geprogrammeerd eiwit is
00:11:49.25zodat één enkel eiwit kan worden gebruikt voor
00:11:52.09elke plek in het DNA waar we
00:11:54.27een breuk zouden willen genereren
00:11:56.13door simpelweg de volgorde te veranderen van het gids-RNA dat geassocieerd is met Cas9. Dus in plaats van te vertrouwen op herkenning van DNA door eiwitten, vertrouwen we op herkenning van DNA door RNA’s.26zoals onderaan te zien is, dus wat dit betekent
00:12:11.03is dat is gewoon een systeem
00:12:12.18dat eenvoudig genoeg te gebruiken is
00:12:15.15dat iedereen met basis moleculaire biologie training
00:12:19.05kan profiteren van dit systeem
00:12:20.29om genoom engineering te doen
00:12:22.20en dus dit is een tool die echt
00:12:26.06ik denk, vult een essentieel
00:12:29.03en voorheen ontbrekende component
00:12:30.24 van wat we de IT gereedschapskist van de biologie zouden kunnen noemen
00:12:33.29 die niet alleen de mogelijkheid bevat
00:12:36.00 om DNA te sequencen en de structuur te bekijken, we weten over de dubbele helix sinds de jaren 1950
00:12:39.2400 en de laatste decennia is het mogelijk geworden om enzymen
00:12:46.09 zoals restrictie-enzymen
00:12:47.26 en de polymerase kettingreactie
00:12:49.09 te gebruiken om bepaalde segmenten
00:12:52.19van DNA en nu met Cas9
00:12:55.10hebben we een technologie die
00:12:57.15facile genoom engineering
00:12:59.13mogelijk maakt, die beschikbaar is voor laboratoria over de hele wereld
00:13:03.07voor experimenten die ze zouden willen doen
00:13:05.08en dit is dus een samenvatting van de technologie
00:13:10.11van het 2-componentensysteem
00:13:11.29het berust op RNA-DNA base paring
00:13:14.16voor herkenning
00:13:15.21en zeer belangrijk vanwege de manier
00:13:18.24e dat dit systeem werkt is het eigenlijk heel eenvoudig om iets te doen dat multiplexing heet
00:13:24.20 wat betekent dat we Cas9 kunnen programmeren
00:13:27.00met meerdere verschillende gids RNA’s
00:13:28.23 in dezelfde cel om meerdere breuken te genereren en dingen te doen zoals grote segmenten van een chromosoom eruit snijden en ze eenvoudigweg in één experiment te verwijderen.
00:13:38.25Dit heeft dus geleid tot een ware explosie
00:13:42.03op het gebied van biologie en genetica
00:13:45.19met veel laboratoria over de hele wereld
00:13:48.08die deze technologie
00:13:49.25opnemen voor allerlei zeer interessante
00:13:51.15en creatieve soorten toepassingen
00:13:53.13en dit is een dia
00:13:54.24die nu eigenlijk bijna verouderd is
00:13:56.11maar om u een idee te geven
00:13:57.14van de manier waarop het veld
00:14:00.07een grote vlucht heeft genomen
00:14:01.08zo publiceerden we ons oorspronkelijke werk over Cas9
00:14:04.10in 2012 en tot dat moment
00:14:07.16was er heel weinig onderzoek
00:14:08.18gaand op CRISPR biologie waar dan ook
00:14:11.12het was een heel klein gebied
00:14:12.19en dan kun je zien dat
00:14:13.27beginnend in 2013 en zich uitbreidend
00:14:16.09tot nu toe is er een
00:14:17.21ongelooflijke explosie in publicaties
00:14:20.16van labs die dit gebruiken als een genoom-engineering technologie
00:14:22.09dus het is echt een heel erg groot veld
00:14:24.Het is dus echt heel opwindend voor mij als basiswetenschapper om te zien hoe wat begon als een fundamenteel onderzoeksproject, uitgroeide tot een technologie die zeer bruikbaar blijkt te zijn voor allerlei soorten spannende experimenten.28van opwindende experimenten
00:14:37.07en ik wilde afsluiten door een paar dingen
00:14:40.07met u te delen
00:14:42.17die gaande zijn met behulp van deze technologie
00:14:44.17zoals natuurlijk aan de linkerkant
00:14:47.13veel basisbiologie die nu kan worden gedaan
00:14:50.02met de engineering van modelorganismen
00:14:53.03en verschillende soorten cellijnen
00:14:55.02die worden gekweekt in het laboratorium
00:14:56.21om het gedrag van cellen te bestuderen
00:14:58.13 maar ook in de biotechnologie om gerichte veranderingen in planten
00:15:05.15 en verschillende soorten schimmels aan te brengen die zeer
00:15:07.11 bruikbaar zouden kunnen zijn voor verschillende soorten industriële toepassingen
00:15:09.29 en dan natuurlijk in de biogeneeskunde
00:15:12.14met veel belangstelling voor het potentieel
00:15:14.14 om deze technologie te gebruiken als een gereedschap
00:15:17.03 om echt met nieuwe therapieën
00:15:21.06 te komen voor menselijke ziekten is denk ik iets
00:15:23.09dat is erg spannend en is echt iets
00:15:26.05dat is al aan de horizon
00:15:27.09 en dan deze dia gewoon echt geeft aan
00:15:30.20 waar ik denk dat we gaan zien dit te gaan
00:15:33.15 in de toekomst met veel interessante
00:15:36.20en creatieve richtingen
00:15:39.03die langskomen in verschillende laboratoria
00:15:41.02zowel in academische onderzoekslaboratoria
00:15:43.19maar ook in toenemende mate in commerciële laboratoria
00:15:45.29ste die het gebruik van deze
00:15:49.24technologie voor allerlei toepassingen mogelijk gaan maken
00:15:52.18vele waarvan we ons zelfs twee jaar geleden nog geen
00:15:54.10 hadden kunnen voorstellen.
00:15:56.05Dus erg spannend en ik wil alleen maar mijn erkentelijkheid uitspreken voor een geweldig team
00:16:01.10van mensen die betrokken zijn geweest bij het werken
00:16:04.22aan het project met mij en we hebben
00:16:06.07verschrikkelijke financiële steun gehad van verschillende groepen
00:16:11.00ook en het is een genoegen geweest
00:16:13.00om dit met u te delen, dank u.