Frontiers in Oncology

Introduction

Het is bekend dat persistente infectie met hoog-risico humaan papillomavirus (hr-HPV) een noodzakelijke oorzaak is voor baarmoederhalskanker en precancereuze laesies (1, 2). Met een onthulde etiologie is baarmoederhalskanker in hoge mate te voorkomen (3, 4). Ontwikkelde landen zijn begonnen met het gebruik van hr-HPV-tests bij de primaire screening op baarmoederhalskanker, hetzij alleen, hetzij in combinatie met cytologie (5-8). Er zijn aanwijzingen dat op HPV gebaseerde screeningprogramma’s een betere bescherming bieden tegen baarmoederhalskanker en baarmoederhalskanker dan andere traditionele screeningmethoden, zoals cytologie (9-11). Aangezien de meeste HPV-infecties echter spontaan verdwijnen, worden met HPV-tests talrijke infecties opgespoord die niet tot baarmoederhalskanker of -precarcinale kanker zullen leiden, vooral bij jonge vrouwen (12). Daarom wordt een HPV-DNA-test niet aanbevolen voor de screening van vrouwen onder de 30 jaar. Bovendien kunnen HPV-positieve patiënten die voor verdere procedures worden doorverwezen, onnodige invasieve interventies ondergaan.

In China waren er in 2015 98.900 nieuwe gevallen en 30.500 sterfgevallen door baarmoederhalskanker (13). Om de stijgende trend van deze maligniteit te beteugelen, heeft de Chinese regering sinds 2009 een landelijk gratis screeningprogramma voor baarmoederhalskanker opgezet voor vrouwen die in plattelandsgebieden wonen, met behulp van VIA/VILI, Papanicolaou (Pap)-test of HPV-test (in proeflocaties), op basis van economische en technologische ontwikkelingsniveaus (14). Door de aard van deze screeningmethoden moet de diagnostische nauwkeurigheid echter worden verbeterd. Bovendien moet, gezien de grote bevolking van China, een nieuw screeninginstrument met een evenwicht tussen gevoeligheid en specificiteit worden geëvalueerd.

Diseasespecifieke moleculaire markers van baarmoederhalskanker bieden een combinatie van hoge gevoeligheid en hoge specificiteit om baarmoederhalsvoorkanker op te sporen. De meeste van deze markers zijn geïdentificeerd op basis van het mechanisme van HPV-gerelateerde carcinogenese. De HPV RNA-tests zijn gebaseerd op de detectie van HR-HPV E6 en E7 mRNA. Het oncogene potentieel van HPV-infectie is afhankelijk van de productie van virale E6/E7 oncoproteïnen. Daarom biedt de detectie van E6/E7 mRNA-transcripten de mogelijkheid voor een specifieke test om precancereuze laesies te detecteren.

In deze studie evalueerden we de klinische prestaties van de HPV E6/E7 mRNA-test om hooggradige cervicale intra-epitheliale neoplasie (CIN) en kanker bij Chinese vrouwen te detecteren.

Materialen en methoden

Deelnemers en procedures

Deze ziekenhuisgebaseerde studie werd uitgevoerd van april tot december 2017 in de provincie Henan, China. Vrouwen die de afdeling gynaecologie van The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) bezochten voor colposcopie werden uitgenodigd. De inclusiecriteria waren als volgt: (1) vrouwen tussen 25 en 64 jaar oud; (2) geen voorgeschiedenis van baarmoederhalskanker of hysterectomie; (3) geen klinische symptomen van zwangerschap of 8 weken na de zwangerschapsafbreking; en (4) begrip van de studieprocedures, en vrijwillige deelname. De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van het Henan Cancer Hospital (HCH). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke deelnemer.

De cervicale exfoliate cellen werden verkregen van vrouwen tijdens het gynaecologisch onderzoek. Het specimen werd bewaard in 20 ml PreservCyt® transportmedium (Hologic Inc., Marlborough, MA, Verenigde Staten) en bewaard bij 4°C. Vervolgens werd een colposcopie-onderzoek uitgevoerd door een gynaecoloog. Vrouwen met abnormale colposcopiebevindingen ondergingen een laesiegerichte biopsie. Als het colposcopie-onderzoek onbevredigend was (de squamocolumnaire junctie was niet volledig zichtbaar), werd endocervicale curettage (ECC) uitgevoerd. Specimens van cervicale geëxfolieerde cellen werden naar het Kanker Instituut en Ziekenhuis, Chinese Academie van Medische Wetenschappen (CICAMS) getransporteerd. De specimens werden verdeeld in twee porties: een celmengsel van 1,5 ml in een EP-buisje voor de HR-HPV DNA-test en HPV E6/E7 mRNA-test. De resterende preservcyt met geëxfolieerde cellen werd gebruikt voor de ThinPrep cytologische test (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, Verenigde Staten). Het Bethesda-rapportagesysteem werd gebruikt voor cytologie door een senior cytoloog (15).

HR-HPV DNA Assay

De 400 μl celmengselmonsters uit 1,5 ml EP-buisjes werden gebruikt voor de detectie van DNA van 14 hr-HPV-types (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, en 68) door Cobas 4800 HPV assay (Roche, Bazel, SUI). Het gepoolde resultaat van de 14 hrHPV, en het afzonderlijke resultaat voor HPV 16 en 18, werden tegelijkertijd gerapporteerd (16). Cobas 4800 was een PCR-gebaseerde test voor HPV-DNA met nucleïnezuurhybridisatie-amplificatie volgens de instructies van de fabrikant. Bij elke test werden negatieve en positieve kwaliteitscontroles ingesteld. Als de ct-waarde groter was dan 40, werd het resultaat als negatief beschouwd. Zo niet, dan was het resultaat positief. De positieve resultaten omvatten drie typen: HPV 16, HPV 18, en andere HPV (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, en 68).

HPV E6/E7 mRNA Testing

Een ml monsters uit 1,5 ml EP-buisjes werden gebruikt voor de detectie van het E6/E7 virale mRNA van de 14 hr-HPV-types in geaggregeerde APTIMA HPV-test (Hologic Inc, Marlborough, MA, Verenigde Staten), volgens de instructies van de fabrikant (17). Het was een test in drie stappen, inclusief mRNA-extractie, amplificatie en detectie van het geamplificeerde product. Indien het kopiegetal groter was dan of gelijk aan 1,0, werd het resultaat als positief beschouwd. Anders was het resultaat negatief.

Histopathologische Diagnose

Biopsie en ECC-weefsels werden naar SAHZU gestuurd voor histopathologische diagnoses volgens het rapportagesysteem voor cervicale intra-epitheliale neoplasie (CIN). Vervolgens beoordeelden histopathologen van HCH alle objectglaasjes. Elke inconsistente pathologische diagnose werd naar het CICAMS gestuurd voor beoordeling. De uiteindelijke diagnose voor elke vrouw was gebaseerd op de slechtste lezing van de panelbeoordeling. Alle waarnemings- en diagnoseprocessen waren blind.

Statistische analyse

De uiteindelijke histopathologische diagnose werd gebruikt als de gouden standaard. Vrouwen met een TCT-diagnose van laaggradige squameuze intra-epitheliale laesie (LSIL) of erger (LSIL +) werden beschouwd als liquid-based cytology (LBC) positief. De HPV DNA resultaten werden gestratificeerd, volgens de HPV types: HPV16/18 (d.w.z. HPV16 en/of HPV18 positief), HPV-anders (d.w.z. elk van de 12 hr-HPV-types positief exclusief HPV16 en HPV18), en HPV-totaal (d.w.z. elk van de 14 hr-HPV-types positief). De absolute schattingen en 95% vertrouwelijke intervallen (95%CI) van positieve percentages, sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde (PPV), en negatief voorspellende waarde (NPV) werden berekend. De verschillen in HPV mRNA expressies in verschillende HPV groepen werden berekend met de chi-kwadraat toets of Fisher’s exact toets. De McNemar test werd gebruikt om de verschillen in sensitiviteit en specificiteit vast te stellen. Het α-niveau werd vastgesteld op 0,05, en p < 0,05 (twee maten) werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

In totaal werden 537 vrouwen in deze analyse geïncludeerd. De gemiddelde leeftijd was 43,88 ± 10,97 jaar. De LBC diagnoses waren: 183 (34,7%) normaal, 135 (25,1%) atypische plaveiselcellen van onbepaalde betekenis (ASC-US), 22 (4,1%) atypische plaveiselcel kan HSIL niet uitsluiten (ASC-H), 7 (1.3%) atypische kliercel (AGC), 82 (15,3%) LSIL, 75 (14,0%) squameuze intra-epitheliale laesie van hoge graad (HSIL), 31 (5,8%) squameuze celcarcinomen (SCC), en 2 (0,4%) adenocarcinoom in situ (AIS). De histopathologische diagnoses waren 298 (55,5%) normaal, 30 (5,6%) cervicale intra-epitheliale neoplasie graad 1 (CIN1), 48 (8,9%) CIN2, 111 (20,7%) CIN3, 43 (8,0%) SCC, en 7 (1,3%) AIS.

Tabel 1 toonde de correlatie tussen mRNA- en DNA-detectie door HPV-types. De totale overeenkomst van de twee tests was 90,7% (95%CI: 87,9, 92,9) met een kappa-waarde van 0,81. De positieve percentages mRNA waren respectievelijk 91,7%, 84,6% en 86,4% bij HPV16/18, HPV-andere en HPV-totaal positieve vrouwen. Alle positieve mRNA-percentages waren hoger bij HPV-positieve vrouwen dan bij HPV-negatieve vrouwen in dezelfde HPV-type groep (alle p < 0,001).

De HPV DNA-, mRNA-, en LBC-positieve percentages stegen met de ernst van de histopathologische diagnose, variërend van respectievelijk 25,5, 19,1, en 11,4% in normaal tot 100,0% in SCC. De positieve percentages van de drie tests bij AIS waren respectievelijk 85,7, 85,7 en 100,0%. Deze drie tests hadden vergelijkbare positieve percentages voor CIN3, SCC en AIS. Maar de positieve percentages van mRNA waren relatief lager bij vrouwen met de diagnose CIN2. De percentages positieve HPV16 waren het hoogst in CIN3, SCC en AIS in vergelijking met andere HPV DNA-groepen. HPV18 positieve percentages waren lager dan 7% in alle plaveiselcellaesies, maar iets hoger (28,6%) in AIS (tabel 2).

Tabel 3 toonde de klinische prestaties van de drie tests bij het opsporen van CIN2+ en CIN3+ laesies. De gevoeligheden voor mRNA voor het opsporen van CIN2+ en CIN3+ bedroegen respectievelijk 93,8% (95%CI: 89,7-96,4) en 95,7% (95%CI: 91,3-97,9), die niet verschilden van die welke met DNA werden opgespoord (95,7% voor CIN2+, 96,3% voor CIN3+), maar hoger waren dan die welke met LBC werden opgespoord (80,4% voor CIN2+ en 88,8% voor CIN3+). De specificiteit voor mRNA voor de detectie van CIN2+ (79,0% ) en CIN3+ (70,5% ) was significant hoger dan die voor DNA (71,0% voor CIN2+, 62,8% voor CIN3+) (p < 0,05), maar lager dan die voor LBC (84,5% voor CIN2+, 79,8% voor CIN3+). De PPVs voor mRNA om CIN2+ en CIN3+ op te sporen waren 74,0% (95%CI: 68,4-78,9) en 58,1% (95%CI: 52,1-63,9), en de NPVs waren respectievelijk 95,2% (95%CI: 92,0-97,2) en 97,4% (95%CI: 94,8-98,8).

Tabellen 4 en 5 tonen de positieve percentages en de klinische resultaten van de drie tests in verschillende leeftijdsgroepen. Samenvattend lieten alle tests betere resultaten zien voor vrouwen ouder dan 30 jaar dan voor jongere vrouwen. HPV DNA-test had de hoogste sensitiviteit, en LBC had de hoogste specificiteit voor het opsporen van CIN2+ en CIN3+ bij vrouwen jonger dan 30 jaar.

Discussie

De gepresenteerde resultaten toonden aan dat de mRNA-test en de DNA-teat een hoge overeenstemming bereikten van 90,7%. De HPV DNA, mRNA, en LBC positieve percentages stegen met de ernst van de histopathologische diagnose, van respectievelijk 25,5, 19,1, en 11,4% in normaal tot 100,0% in SCC. De gevoeligheden voor mRNA voor het opsporen van CIN2 en CIN3+ bedroegen 93,8% en 95,7%, die vergelijkbaar waren met die voor DNA (95,7% voor CIN2+ en 96,3% voor CIN3+). Maar de specificiteiten voor mRNA (79,0% voor CIN2+ en 70,5% voor CIN3+) waren significant hoger dan die gedetecteerd door DNA (71,0% voor CIN2+ en 62,8% voor CIN3+).

In deze studie vertoonden de HPV E6/E7 mRNA-test en HPV DNA-test een hoge overeenkomst. Van de HPV 16/18 DNA-positieve vrouwen was 91,7% ook positief op mRNA, wat vergelijkbaar is met andere studies, die een algemene overeenkomst van meer dan 90% meldden tussen APTIMA HPV-test en HPV DNA-tests (17, 18), en consistent hogere positieve percentages voor HPV DNA-test in verschillende populaties (19, 20). Wij stelden hogere positieve percentages vast bij oudere vrouwen dan bij jongere vrouwen, wat licht afweek van andere studies (21-23). Deze variatie kan worden toegeschreven aan de studieopzet (d.w.z. een ziekenhuisgebaseerde studie), die de extrapolatie van de bevindingen naar de algemene bevolking beperkt. Interessant is dat het percentage discordanten hoger was bij vrouwen van 30 jaar of jonger (25,6% vs. 8,6%). Studies hebben een hoger percentage spontane klaring voor HPV-infectie aangetoond bij jongere vrouwen, wat wijst op een lagere mogelijkheid van HPV-integratie (24).

Zoals bekend detecteren op DNA gebaseerde HPV-tests de aan- of afwezigheid van HPV-DNA. De meeste HPV-infecties zijn echter van voorbijgaande aard, binnen een jaar spontaan gewist, wat niet zou leiden tot baarmoederhalskanker of -kanker (25). E6/E7 mRNA-expressie komt alleen voor in actief geïnfecteerde cellen en neemt toe tijdens de ontwikkeling en progressie van CIN (26). Daarom wordt verondersteld dat de HPV mRNA-test specifieker is in het opsporen van hooggradige cervicale laesies. Onze gegevens bevestigden deze hypothese. Wij vonden dat de mRNA-test even gevoelig was als de DNA-test, maar specifieker in het opsporen van baarmoederhalskanker en baarmoederhalskanker. Andere onderzoekers trokken soortgelijke conclusies bij primaire screening (20) of triage van vrouwen met geringe afwijkende cytologie (27). In onze studie hadden 50 vrouwen discordante resultaten tussen HPV DNA- en mRNA-test. Onder hen werden 34 DNA + /mRNA- versus 8 mRNA + /DNA- gediagnosticeerd als normaal of CIN1; 6 versus 2 werden gediagnosticeerd als CIN2 of CIN3; er werd geen testverschil waargenomen bij kankers. Als we de HPV-DNA-test vervangen door de mRNA-test, zouden dus 34 vrouwen niet worden doorverwezen voor onnodige colposcopie, maar zouden 4 CIN2 en 2 CIN3 worden gemist. Ondanks het missen van 6 gevallen ging er geen sensitiviteit verloren, maar nam de specificiteit toe. Uit de literatuur bleek dat 40-60% van de CIN2 gevallen binnen 2 jaar zouden regresseren (28, 29), en niet alle CIN3 gevallen waren echte pre-kanker laesies (30). Cook et al. vonden ook een laag CIN2+ percentage bij mRNA-/DNA + vrouwen (17). Daarom was het risico van invasieve kanker voor de 6 vrouwen laag in een kort tijdsinterval.

We evalueerden ook de testprestaties bij oudere en jongere vrouwen. Uit de leeftijdsspecifieke analyse bleek dat de drie tests beter functioneerden bij vrouwen ouder dan 30 jaar. Op basis van het feit dat jongere vrouwen met CIN-laesies een grotere kans op regressie hadden, stellen wij een conservatieve behandeling van jongere vrouwen voor. Studies hebben aangetoond dat HPV-infectie vaak voorkomt bij jonge vrouwen, maar dat een groot deel van deze infecties van voorbijgaande aard zijn en spontaan kunnen verdwijnen (31, 32). De korte duur van de meeste HPV-infecties bij deze vrouwen suggereert dat de geassocieerde cervicale dysplasie conservatief moet worden behandeld (12). Daarom is de HPV-DNA-test wellicht geen geschikte screeningmethode voor vrouwen jonger dan 30 jaar, vanwege het hoge fout-positieve percentage. De screeningsprestaties van cytologie en E6/E7 mRNA in hun totaliteit bij jonge vrouwen moeten worden geëvalueerd. In onze studie toonden de gegevens aan dat cytologie de hoogste specificiteit had bij vrouwen jonger dan 30 jaar, maar dat de sensitiviteit lager is dan de HPV-DNA-test. Voor E6/E7 mRNA was de prestatie echter matig bij vrouwen jonger dan 30 jaar, met een hogere sensitiviteit dan cytologie en een hogere specificiteit dan HPV-DNA, wat suggereert dat E6/E7 mRNA-tests een veelbelovende optie kunnen zijn voor de screening van vrouwen jonger dan 30 jaar.

Hoewel de Chinese Food and Drug Administration drie profylactische HPV-vaccins heeft goedgekeurd (d.w.z. Cervarix, Gardasil en Cecolin), berust de preventie van baarmoederhalskanker nog steeds op screening. In 2009 is de Chinese regering begonnen met een landelijke gratis screening op baarmoederhalskanker voor vrouwen op het platteland. In 2015 werd de HPV-DNA-test voor het eerst gebruikt als een primair screeninginstrument in proeflocaties. Door de grote populatie zou een HPV DNA-gebaseerde screening echter leiden tot onvermijdelijke enorme fout-positieven, wat leidt tot een verspilling van gezondheidsmiddelen en onnodige ongerustheid. Het is veelbelovend dat mRNA zou kunnen worden gebruikt in het nationale screeningprogramma voor baarmoederhalskanker om het aantal vals-positieven te verminderen zonder aan gevoeligheid in te boeten.

Er zijn verschillende beperkingen die in deze studie moeten worden aangepakt. Ten eerste is dit een cross-sectionele studie, en konden we het risico van laesieprogressie geassocieerd met HPV E6/E7 mRNA niet evalueren. We hebben onze gegevens echter gestratificeerd naar histologische graad, wat informatie geeft over de correlatie. Ten tweede is het belangrijk op te merken dat de resultaten niet volledig kunnen worden gegeneraliseerd naar de algemene bevolking, omdat de deelnemers aan de studie poliklinisch in het ziekenhuis werden gerekruteerd.

Concluderend had de APTIMA mRNA-test een goede overeenkomst met de Cobas 4800 HPV DNA-test met vergelijkbare sensitiviteit en hogere specificiteit om hooggradige cervicale laesies op te sporen. Het is veelbelovend dat mRNA zou kunnen worden gebruikt in China’s nationale screeningprogramma voor baarmoederhalskanker om het aantal vals-positieven te verminderen zonder enige gevoeligheid te verliezen. Verdere studies zijn nodig om de klinische prestaties van mRNA-test bij jongere vrouwen in China te evalueren.

Verklaring van beschikbaarheid van gegevens

Alle datasets die voor deze studie zijn gegenereerd, zijn opgenomen in het artikel/aanvullend materiaal.

Verklaring van ethiek

De studies waarbij menselijke deelnemers betrokken waren, werden beoordeeld en goedgekeurd door de rol van co-expressie van HPV E6/E7-mRNA en p16/Ki-67-eiwit bij het voorspellen van het risico op baarmoederhalskanker. Door de Life Science Ethics Review Committee van Zhengzhou University. De patiënten/deelnemers gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan deze studie.

Author Contributions

S-KZ droeg bij aan het ontwerp en schreef het manuscript. ZG heeft bijgedragen aan het schrijven en reviseren van het manuscript. PW, M-MJ, en P-PG droegen bij aan het onderzoek en de HPV DNA test. L-NK en Z-NW droegen bij aan de HPV mRNA test. D-MZ droeg bij aan cytologisch en histologisch onderzoek. QC en X-QC voerden de statistische analyse uit. X-BS hielp bij het opzetten van de studie en assisteerde bij de statistische analyses. Y-LQ en J-GZ hielpen bij het opzetten van de studie en assisteerden bij het schrijven van het manuscript. J-GZ assisteerde bij de uitvoering van de studie. Alle auteurs lazen en keurden het uiteindelijke manuscript goed.

Funding

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81502475) en Science and Technology Project van de provincie Henan (Grant No. 172102310067).

Conflict of Interest

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Acknowledgments

Alle vrouwen die betrokken waren bij deze studie worden erkend voor hun deelname. Wij waardeerden ook de bijdrage van alle relevante artsen voor deze studie en de hulp van het National Cancer Center, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, en Peking Union Medical College. We waardeerden ook 32e International Papillomavirus Conference (IPVC 2018) voor het bieden van een platform om het abstract van de studie te presenteren (titel: Clinical Performance of HPV E6/E7 mRNA test to Detect Cervical High-grade Intraepithelial Neoplasia and Cancer: A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session).

Afkortingen

hr-HPV, hoog-risico humaan papillomavirus; VIA/VILI, visuele inspectie met azijnzuur/visuele inspectie met Lugol’s jodiumoplossing; Pap, papanicolaou; SAHZU, Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95%CI, 95% vertrouwelijke intervallen; ECC, endocervicale curettage; TCT, ThinPrep cytologische test; CIN, cervicale intra-epitheliale neoplasie; LSIL, laaggradige squameuze intra-epitheliale laesie; HSIL, hooggradige squameuze intra-epitheliale laesie; LBC, cytologie op basis van vloeistof; PPV, positief voorspellende waarde; NPV, negatief voorspellende waarde; ASC-US, atypische plaveiselcellen van onbepaalde significantie; ASC-H, atypische plaveiselcel kan HSIL niet uitsluiten; AGC, atypische kliercel; SCC, plaveiselcelcarcinomen; AIS, adenocarcinoom in situ.