BIOPROCESS ENGINEERING
Evaluatie van de microbiële diversiteit van denitrificerende bacteriën in batchreactoren
S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*
ABSTRACT
Microbiële gemeenschappen in een industriële actiefslibinstallatie kunnen bijdragen tot het denitrificatieproces, maar de informatie over de micro-organismen aanwezig in denitrificerende reactoren is nog schaars. Verwijdering van anorganische stikstofverbindingen kan worden bereikt door de toevoeging van koolstofbronnen aan het biologische denitrificatieproces. Ethanol is een economisch levensvatbaar alternatief als koolstofbron in tropische landen zoals Brazilië, waar op grote schaal suikerriet wordt geproduceerd. In dit document wordt verslag gedaan van de succesvolle toepassing van actief slib met nitraat en ethanol in een anaërobe batchreactor. De werking duurde 61,5 uur met een totaal nitraatverbruik in 42,5 uur, nitrietproductie (2,0 mg/l) en ethanolverbruik (830,0 mg/l) in 23,5 uur. Het aantal denitrificerende cellen met het meest waarschijnlijke aantal was aan het begin van de operatie lager dan aan het eind, hetgeen bevestigt dat het inoculum uit actief slib geschikt is voor het denitrificatieproces. Aan de hand van de celtellingen werden de monsters geïdentificeerd als Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. en ongekweekte bacteriën. Deze soorten kunnen dus betrokken zijn bij de nitraatreductie en het ethanolverbruik in de batchreactor.
Keywords: Actiefslibsysteem; Acidovorax; Acinetobacter; Nitraat; Ethanol.
INLEIDING
Micro-organismen die in staat zijn tot denitrificatie zijn wijdverspreid in de natuur: bodem, sediment, zoetwater, zee en afvalwaterzuiveringssystemen (Park & Yoo, 2009).
Veel inocula van huishoudelijke en industriële rioolwaterzuiveringsinstallaties kunnen denitrificerende bacteriën bevatten, voornamelijk in actiefslibsystemen (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), waar de biologische stikstofverwijdering plaatsvindt om denitrificatie te bevorderen, d.w.z. onder heterotrofe anoxische omstandigheden fungeren de organische koolstofbronnen als elektronendonoren en reduceren ze nitraat tot stikstofgas (Canto et al., 2008). De aanwezigheid van organische koolstof en energiebronnen is noodzakelijk voor heterotrofe denitrificatie (Nava et al., 2010).
De meeste denitrificerende bacteriën behoren tot de Proteobacteria Phylum, waaronder Acidovorax, Comamonas en Acinetobacter. Dergelijke bacteriën kunnen aanwezig zijn bij afvalbehandeling, vooral in actiefslibsystemen, die moleculaire stikstof kunnen vormen uit nitraat en een exogene koolstofbron, zoals ethanol. De volledige denitrificatie, d.w.z. de omzetting van nitraat in stikstofgas, wordt bemiddeld door bacteriesoorten die normaal zuurstof uit de lucht als energiebron gebruiken (aërobe ademhaling), maar zij hebben ook het vermogen om nitraat en nitriet te gebruiken in plaats van zuurstof (anoxische toestand). Deze bacteriën kunnen dus aëroob groeien bij afwezigheid van nitraat, of onder anoxische omstandigheden bij aanwezigheid van nitraat. De omzetting van nitraat in moleculaire stikstof staat ook bekend als anoxische ademhaling (Park & Yoo, 2009).
Er is een grote verscheidenheid aan organische verbindingen gebruikt, zoals methanol, ethanol, glucose, acetaat, aspartaat of mierenzuur en aromatische verbindingen (Queiroz et al., 2011). In het meeste gepubliceerde onderzoek naar drinkwaterdenitrificatie wordt echter gebruik gemaakt van methanol, ethanol en azijnzuur (Park & Yoo, 2009). Ethanol (Daniel et al., 2009), glucose en acetaat zijn enkele van de externe elektronendonoren die met succes worden gebruikt voor denitrificatie. Met name in Brazilië vormt ethanol een haalbaar alternatief (Gavazza dos Santos et al., 2004). Ethanol wordt op grote schaal geproduceerd in Brazilië sinds 1975, met het Nationale Programma voor Alcohol (19751985). Brazilië produceert bijna 2,6 x 108 ton suikerriet, dat door 324 suikerfabrieken wordt verwerkt tot suiker en ethanol (Borrero et al., 2003). Suikerriet wordt in overvloed geproduceerd en kost meestal minder dan andere geschikte koolstofbronnen. Niettemin verhoogt de behoefte aan extra elektronendonorbronnen voor exogene processen de operationele kosten, wat mogelijk een nadeel is voor het gebruik van innovatieve, op anaerobe processen gebaseerde technologieën (Gavazza dos Santos et al, 2004).
De stoichiometrische relaties die de bacteriële energiereactie beschrijven (Park & Yoo, 2009) wordt als volgt geschreven, wanneer ethanol als koolstofbron wordt gebruikt:
0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O
Hoewel deze vergelijking de stoichiometrische hoeveelheid ethanol aangeeft die nodig is voor nitraatdissimilatie, is er extra ethanol nodig voor de-oxygenatie en celsynthese. In de praktijk wordt 25% tot 30% van het vereiste ethanol gebruikt voor de bacteriële celsynthese. Wanneer opgeloste zuurstof aanwezig is, is de ethanolbehoefte dienovereenkomstig groter. Daarom is een gangbare werkwaarde van de gewichtsverhouding tussen substraat en nitraat (C:N03) bijna 3 (Park & Yoo, 2009).
Er zijn slechts enkele referenties over batchreactoren en het denitrificatieproces. Deze opstellingen kunnen worden gebruikt om de voedingsbehoeften te onderzoeken (Maintinguer et al., 2008). Het denitrificatieproces met complexe koolhydraten wordt geëvalueerd in batchreactoren omdat de organische stofdeeltjes die in deze systemen aanwezig zijn de werking in andere configuraties, zoals met zetmeel, kunnen bemoeilijken (Iamamoto, 2006). Bovendien blijft de biomassa in de batchreactor gedurende alle bedrijfsperioden behouden in vergelijking met continu werkende reactoren. Deze feiten kunnen bijdragen tot het totale nitraatverbruik dat in de batchreactor is geverifieerd (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).
De nitraatverwijdering met actiefslibinoculum is vooral bestudeerd in landen met een gematigd klimaat. Er zijn weinig rapporten van studies over nitraatverwijdering en moleculaire biologie met actief slibinoculum uit tropische landen zoals Brazilië. In die zin was het eerste doel van onze studie de evaluatie van het denitrificatieproces met actief slib als inoculum uit tropische klimaten. Het tweede doel van onze studie was het uitvoeren van een microbiële karakterisering van het inoculum met als doel de potentiële organismen te identificeren die specifiek betrokken zijn bij het denitrificatieproces.
Dit werk bestudeerde de microbiële diversiteit van denitrificatie in een batchreactor gevoed met ethanol en nitraat met behulp van technieken van moleculaire biologie en traditionele methodologie van microbiologie.
MATERIAAL EN METHODEN
Batchreactor
Het experiment werd uitgevoerd met slib uit het actiefslibsysteem van de zuiveringsinstallatie van Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brazilië).
De batchreactoren werden in drievoud bereid in Duran®-flessen van 2 L, waarvan 1 L reactiemedium, 10% (v/v) inoculum (100 mL/L).
De reactoren werden gedurende 20 min na de verdeling van de oplossingen aan een N2-atmosfeer (99,99%) onderworpen. Daarna werden ze afgedekt met butylrubber stoppen, omwikkeld en bewaard bij 25 ºC ± 1 ºC, met agitatie bij 120 rpm gedurende 61,5 uur.
Fysisch-chemische en chromatografische analyse
De totale vluchtige vaste stoffen (TVS) en het nitraatverbruik werden spectrofotometrisch bepaald volgens APHA, 2005. De nitrietanalyse werd uitgevoerd door flowinjectie (FIA APHA, 2005). De vluchtige vetzuren en alcoholen werden bepaald door gaschromatografie in een Shimadzu GC-2010, uitgerust met een vlamionisatiedetector, autosampler voor headspace COMBI-PAL – AOC model 5000 en HP-INNOWAX kolom (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm filmdikte), volgens Maintinguer et al, 2008).
Kwantificering van denitrificerende bacteriën
Het meest waarschijnlijke aantal (MPN) denitrificerende bacteriën werd uitgevoerd bij vijf maal de verdunning aan het begin en aan het einde van de werking van de batchreactor, volgens Tiedje (1982), aangepast voor vloeibare monsters. De celtellingen volgens de MPN-methode werden uitgevoerd na 15 dagen incubatie, volgens APHA, 2005. De samenstelling van het kweekmedium en de nitraat- en ethanolconcentraties die bij de MPN-tests werden gebruikt, waren vergelijkbaar met die van de batchreactor, zoals eerder vermeld.
Moleculaire biologie
De monsters voor analyse van het 16S rRNA werden verkregen uit de hoogste positieve verdunningstellingen (MPN) van denitrificerende bacteriën aan het eind van de test uit de batchreactoren.
Totaal genomisch DNA van de monsters werd verkregen na cellysis met glasparels (Sigma) en fenol-chloroformextractie zoals eerder beschreven door Griffiths et al. (2000) gewijzigd.
De amplificatie door de polymerase kettingreactie (PCR) werd uitgevoerd met een bacteriedomein primerset voor het 16S rRNA gen, 27 forward (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) en 1100 reverse (5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). De PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22.331) amplificatie werd uitgevoerd met initiële denaturatie bij 94 ºC gedurende 5 min gevolgd door 30 cycli van denaturatie bij 94 ºC gedurende 45 s, annealing bij 55 ºC gedurende 45 s, extensie bij 72 ºC gedurende 1,45 min en uiteindelijke extensie bij 72 ºC gedurende 7 min en afkoeling bij 4 ºC.
Monsters van PCR-producten (polymerasekettingreactie) (16S rRNA) werden gekloond in de plasmidevector pGEM (Promega Easy Vector System I) volgens de specificaties van de fabrikant. De klonen werden willekeurig geselecteerd en door PCR geamplificeerd. Nucleotide sequencing werd uitgevoerd op een geautomatiseerde ABI 310 PRISM sequencer (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) volgens de instructies van de fabrikant met gebruikmaking van een M13 forward primer (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983). De PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) amplificatie werd uitgevoerd met initiële denaturatie bij 94 ºC gedurende 2 min, gevolgd door 25 cycli van denaturatie bij 94 ºC gedurende 1 min, annealing bij 55 ºC gedurende 1 min, extensie bij 72 ºC gedurende 1 min; en uiteindelijke extensie bij 72 ºC gedurende 7 min en afkoeling bij 4 ºC.
De nucleotide-sequenties werden verwerkt en ze werden uitgelijnd met het Seqman-programma (Lasergene DNAstar-pakket) om de signalen van de vector en basen van lage kwaliteit te verwijderen. De uitgelijnde sequenties werden door het BLAST-zoekprogramma op de NCBI-website vergeleken met de sequenties van het 16S rRNA-gen organisme, vertegenwoordigd in de databank Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) en Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). De fylogenetische boom werd geconstrueerd door de Neighbor-Joining methode (Saitou & Nei, 1987) met behulp van het programma MEGA versie 4.1 (Kumar et al., 2008). Bootstrap resampling analyse voor 1000 replicaten werd uitgevoerd om de betrouwbaarheid van de boomtopologieën te schatten. De bekende sequenties van Aspergillus niger (FJ828924.1) werden toegevoegd en deze werden gebruikt als out-group.
RESULTATEN EN DISCUSSIE
Het nitraat was volledig verbruikt na 42,5 uur werking (figuur 1). De nitrietproductie werd gereduceerd (2,0 mg/l op 18,5 uur) en vond plaats binnen 23,5 uur na de inwerkingstelling. 1,06 g ethanol/l (36% verbruik) werd waargenomen na 13,5 uur werking bij een beginconcentratie van 1.650 mg/l. Het ethanolverbruik aan het einde van het experiment bedroeg 54% (0,77 g/L in 61,5 uur). Deze resultaten kwamen overeen met die van Gusmão et al. (2006). De auteurs (op.cit.) stelden een nitraatverbruik vast van 98,9% in 14 uur werking, met gezuiverde cellen van korrelslib van een up-flow anaëroob slibdeken (UASB) dat afvalwater behandelt van een pluimveeslachterij (DAKAR-Tietê SP Brazilië), met nitraat (350 N-NO3 mg/L), ethanol (377 mg/L) en benzeen (10 mg/L) als koolstofbronnen.
Methanol (197,78 mg/L) en n-butanol (23,50 mg/L) werden aan het begin van het experiment gedetecteerd. Deze alcoholen (metanol en n-butanol) waren mogelijk aanwezig in het inoculum. De concentratie van de alcoholen vertoonde weinig variatie tot het einde van de test, wat erop wijst dat ze niet werden verbruikt onder deze denitrificerende omstandigheden (figuur 2).
De maximale azijnzuurproductie bedroeg 16,7 mg/L bij 61,5 uur werking. De waarden van STV aan het begin en aan het eind van de werking van de batchreactor waren respectievelijk 5,14 g/L en 11,40 g/L, wat wijst op een toename van de biomassa met 122%. Deze resultaten toonden aan dat de aan de batchreactor opgelegde operationele omstandigheden bevorderlijk waren voor de ontwikkeling en de duurzaamheid van het bacteriële consortium onder denitrificerende omstandigheden.
In deze studie werd het proces van denitrificatie waargenomen, zoals ook werd beschreven door andere auteurs die verschillende configuraties voor de reactoren gebruikten.
Callado & Foresti (2001) liet anaërobe reactoren gevoed met synthetisch substraat dat huishoudelijk afvalwater simuleert, werken om de grootste fractie koolstofhoudend materiaal te verwijderen en om de nitrificatie van het substraat, denitrificatie en biologische fosfaatverwijdering in dezelfde batchcyclus te bevorderen, in een sequentiële anaërobe/aërobe/anaërobe batchreactor. Het systeem werd gedurende 41 dagen met 84 cycli van 12 uur, bij een temperatuur van 28±1 ºC, in bedrijf gehouden. De auteurs (op.cit.) stelden vast dat de denitrificatie plaatsvond onder afwisselend aerobe en anoxische omstandigheden in de reactiefase. Beide processen traden alleen op wanneer natriumacetaat (500 mg/L) werd toegevoegd aan het begin van de anoxische fase.
Etchebehere et al. (2001) testten acetaat (40 mmol/L) en glucose (13 mmol/L) als koolstofbronnen voor denitrificatie in een anaërobe batchreactor met kaliumnitraat (20mmol/L) voor drie verschillende inocula: slib uit een anoxische reactor (laboratoriumschaal) om koolstof en stikstof te verwijderen uit het percolaat van een sanitaire stortplaats; slib uit een UASB-methanogene reactor die mout behandelt en slib uit een anoxische reactor gevoed met acetaat en nitraat. Nitraat werd volledig verbruikt uit de drie geteste slibmonsters, zoals in de onderhavige studie is waargenomen. De auteurs (op.cit.) concludeerden dat acetaat een betere koolstofbron is dan glucose.
Gavazza dos Santos et al. (2004) bestudeerden het denitrificatieproces in batchreactoren gevoed met synthetisch afvalwater dat genitrificeerde effluenten van huishoudelijke rioolwaterzuiveringsinstallaties simuleert, met gebruikmaking van drie elektronendonorbronnen: methanol (53,3 mg/L), ethanol (38,3 mg/L) en methaan (naast het synthetische afvalwater). De auteurs (op.cit.) stelden vast dat de meest doeltreffende elektronendonor ethanol was, dat nitriet en nitraat volledig verwijderde, zoals in dit werk is waargenomen.
Iamoto (2006) behaalde een stikstofverwijdering van meer dan 84% in een sequentiële batchreactor gevoed met zetmeel en ammonium in afwisselend anoxische en aerobe omstandigheden (cycli van 2u/2u) en 2 mg O2/L voor de volgende concentraties: 125 mg N-NH4/L en 0,95 g zetmeel/L, 250 mg N-NH4/L en 1,9 g zetmeel/L, 500 mg N-NH4/L en 3.8 g zetmeel/l, met inoculum uit een actiefslibsysteem van een rioolwaterzuiveringsstation (Flores da Cunha Rio Claro SP Brazilië). Ethanol (1.500 mg/L) werd ook getest als koolstofbron samen met 500 mg NH4-N/L. De auteurs (op.cit.) stelden vast dat de nitriet- en nitraatverwijdering volledig (100%) was, zoals waargenomen in de huidige studie, hetgeen de haalbaarheid aantoont van het gebruik van ethanol in het denitrificatieproces.
De denitrificerende celtellingen volgens MPN aan het begin van de werking van de batchreactor waren lager (1,1 x 1010 MPN/mL) dan aan het einde van de werking (1,2 x 1019 MPN/mL) (figuur 3). Deze resultaten zijn hoger dan die welke in de literatuur zijn gerapporteerd en hieronder worden beschreven.
Etchebehere et al. (2001) telden de denitrificerende cellen volgens het meest waarschijnlijke aantal (MPN) in een basismedium aangevuld met gistextract (0,5 g/L), kaliumacetaat (1,84 g/L) en kaliumnitraat (0,72 g/L) en verkregen 9,6 x 106 MPN/mL met slib uit de anoxische reactor van een percolaatbehandelingssysteem. Callado en Foresti (2001) gebruikten natriumacetaat als koolstofbron in een sequentiële anaerobe/ aerobe/anaerobe batchreactor en vonden meer MPN denitrificerende bacteriën aan het begin van de operatie (2,5 x 106 MPN/mL) dan aan het eind (3,5 x 105 MPN/mL). De auteurs (op.cit.) concludeerden dat deze daling geen invloed had op het denitrificatieproces.
Iamoto (2006) verkreeg dezelfde orde van grootte in het MPN van denitrificerende bacteriën aan het einde van de werking van een sequentiële batchreactor met 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 MPN/mL) en 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), beide met toevoeging van zetmeel (1.900 mg/L) als koolstofbron en inoculum van actief slib van een waterzuiveringsinstallatie (Rio Claro SP – Brazilië).
De denitrificerende bacteriën werden begunstigd door de voedingsconditie opgelegd in de anoxische reactor. Dit feit bevestigde het vermogen van het inoculum uit actief slib voor het denitrificatieproces.
Vijftig klonen werden verkregen uit het geanalyseerde monster voor klonering en sequenering van de 16S rRNA genfragmenten van het microbieel consortium. Klonen met waarden van minder dan 180 nucleotiden werden echter niet in de fylogenetische analyse opgenomen omdat zij niet voldoende waren om met de hieronder beschreven database te worden vergeleken. De sequenties van klonering en sequencing werden verkregen uit het positieve MPN-monster met de hoogste verdunning (10-18) (tabel 1).
Acinetobacter sp. werd geïdentificeerd met overeenkomsten van: 98% (klonen 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 en 2, 4, 18, 20, 23 en 27) en 99% (klonen 6, 15, 16, 37 en 38). Het is een Gram-negatieve bacterie, niet-motiel, oxidase-negatief, niet-fermentatief, in paren en behoort tot de Proteobacteria Phylum, Moraxellaceae Family. Het is een belangrijk micro-organisme in de bodem, waar het kan bijdragen tot de mineralisatie, bijvoorbeeld van de aromatische verbindingen (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) isoleerden Acinetobacter-stammen in een monster van een actiefslibsysteem (Jizhuangzi Tianjin – China). Deze stam was in staat om fenol (1,1 g/L) biologisch af te breken door vrije en geïmmobiliseerde cellen. Geng et al. (2006) isoleerden fenolafbrekende bacteriën in een monster van een actiefslibbehandelingssysteem (Singapore). Biochemische tests toonden aan dat deze micro-organismen kunnen groeien in aanwezigheid van ethanol, glucose, sacharose en aromatische verbindingen zoals tolueen, fenol en benzoaat. Het werd beschreven als een nieuwe soort, Acinetobacter EDP3. De auteurs (op.cit.) concludeerden dat deze soort kan worden gebruikt om fenolverbindingen te verwijderen of voor in situ bioremediëring van fenol in de bodem. Cai et al. (2009) identificeerden 58 resistente bacteriën uit met arseen verontreinigde bodem. De Acinetobacter-, Agrobacterium-, Arthrobacter-, Comamonas-, Rhodococcus-, Pseudomonas- en Stenotrophomonas-stammen werden geïdentificeerd in hoge concentraties (20 mM Ar/L). Acinetobacter sp. geïdentificeerd in dit werk hadden hun groei te wijten aan de operationele omstandigheden opgelegd en zou kunnen bijdragen tot denitrificatie.
De klonen 24 en 26 waren vergelijkbaar met Comamonas sp. met gelijkenissen van 98% en 97%, respectievelijk. Comamonas zijn Gram-negatieve bacteriën die behoren tot de Proteobacteria Phylum, Comamonadaceae Family. Etchebehere et al. (2001) isoleerden Gram-negatieve denitrificerende bacteriën uit een anoxische reactor die wordt gebruikt voor de behandeling van percolatiewater van stortplaatsen in Montevideo (Uruguay). De geïsoleerde soort vertoonde gelijkenis met Comamonas terrigena. Dit micro-organisme werd echter als een nieuwe soort beschouwd en kreeg de naam Comamonas nitrativorans. Het werd beschreven als een gramnegatieve bacterie, polair beweeglijk flagellum, aëroob en chemoorganotroof. Deze soort groeide in ethanol, acetaat en butyraat, nitraat, nitriet en kan nitraat tot N2 reduceren.
De in deze studie geïdentificeerde Comamonas-soorten waren dus aanwezig in het inoculum van actief slib en konden bijdragen tot de denitrificatie die in de proeven optrad.
De klonen 25, 28, 34, 36, 42 en 65 waren vergelijkbaar met Acidovorax sp. met gelijkenissen van respectievelijk 99% en 97% (tabel 1). Acidovorax sp. behoort tot de Proteobacteria Phylum; hij wordt gemakkelijk aangetroffen in actief-slibsystemen. Vele Acidovorax-soorten fungeren als regulerende micro-organismen van microbiologische zuiveringsprocessen in actiefslibsystemen. Verscheidene Acidovorax-soorten worden gebruikt bij de biologische afbraak van kunststoffen en bij de verwijdering van andere organische verontreinigingen, waaronder nitrofenolen, nitrobenzeen en polychloorbifenylen door denitrificatie (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) isoleerden denitrificerende bacteriesoorten die PHBV (poly-3-hydroxy-butyraat-co-3-hydroxyvaleraat) afbreken uit drie actiefslibsystemen die worden gebruikt voor de behandeling van stedelijk afvalwater (Nagoya, Osaka, en Toyohashi – Japan). De 37 geanalyseerde klonen vertoonden overeenkomsten met organismen die behoren tot de klasse Betaproteobacteria. De meeste klonen vertoonden gelijkenis met de Acidovorax-soort, wat bevestigt dat deze soort betrokken was bij de PHBV-afbraak onder denitrificerende omstandigheden. Gentile et al. (2007) isoleerden soortgelijke soorten als Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium en Achromobacter uit een denitrificerende reactor die werkte met ethanol (40,0 g/L) en melkzuur (40,0 g/L) als koolstofbronnen; zij testten afzonderlijk elektronendonoren en als stikstofbron werd nitraat (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L) gebruikt. De auteurs (op. cit.) concludeerden dat volledige nitraatreductie tot N2 werd uitgevoerd door Acidovorax soorten, terwijl Achromobacter sp. en Delftia acidovorans verantwoordelijk waren voor onvolledige nitraatdenitrificatie tot nitriet. Daarom waren Acidovorax-soorten aanwezig in de monsters die in deze studie werden geanalyseerd en zij zouden betrokken kunnen zijn bij de denitrificatie die in de batchreactor plaatsvond.
Ongekweekte bacteriestammen van de Rhodocyclaceae-familie werden geïdentificeerd met 98% overeenkomst (kloon 9 – AY945917.1 en klonen 46, 84 AY945905), zoals blijkt uit tabel 1. De leden van de Rhodocyclaceae-familie zijn Gram-negatieve bacteriën die behoren tot de klasse van de Betaproteobacteria. Het zijn denitrificerende aërobe staven met een veelzijdige metabolische capaciteit. De meeste soorten leven in aquatische habitats en oligotrofe bodemomstandigheden. Veel van hen komen voor in afvalwater en spelen een belangrijke rol bij de biologische sanering van dergelijke plaatsen (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006) voedden een denitrificerende reactor met chinoline (40 mg/L), een giftig amine dat wordt gebruikt bij de fabricage van kleurstoffen, pesticiden en synthetische brandstoffen, glucose (180 mg/L), nitraat en kaliumfosfaat (C/N/P van 150:30:1). Het inoculum was afkomstig uit de tweede bezinktank van het rioolwaterzuiveringssysteem van de Industrie Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japan). De quinolineverwijdering bedroeg 90,2% na de steady-state reactorperiode (6 weken). Moleculair-biologische analyses van het inoculum en van de denitrificerende reactor brachten in beide proeven ongecultiveerde bacteriën, Thauera en Azoarcus aan het licht. Volgens de auteurs waren de percentages klonen van bacteriën behorende tot Azoarcus en Thauera respectievelijk 74% in de denitrificatiereactor en 4% in het inoculum. De kennis van micro-organismen uit milieumonsters is afhankelijk van laboratoriumomstandigheden met zuivere culturen (Pace, 1997). Minder dan 1% van de bacteriën uit verschillende ecosystemen is echter bekend (Amann, 1995), oftewel ruwweg 99% is niet bestudeerd en geïdentificeerd. Daarom verwachtten wij in dit werk soortgelijke sequenties te verkrijgen van ongecultiveerde bacteriën.
De fylogenetische boom die werd verkregen met consensus primers voor het Bacteria-domein in moleculair-biologische analyses van het experiment is afgebeeld in figuur 4.
De coëfficiënten van overeenkomst tussen de verschillende groepen micro-organismen bedroegen 97% tot 99% en zij wezen op de aanwezigheid van fylogenetisch verwante soorten, gebaseerd op de partiële evaluatiesequenties van het 16S rRNA-gen. Bekende sequenties van soorten waren afkomstig uit de NCBI database met Aspergillus niger (FJ828924.1) als out-group sequentie van.
Daaruit bleek dat Acidovorax, Comamonas en Acinetobacter soorten geïdentificeerd in deze studie aanwezig waren in het actief slib systeem van Volkswagen São Carlos Motors en dat zij betrokken zouden kunnen zijn bij de nitraat reductie en ethanol consumptie.
CONCLUSIES
Het potentieel van het inoculum van een actiefslibsysteem en het gebruik van ethanol als koolstofbron in een denitrificatieproces zijn aangetoond in een batchreactor.
De in deze studie verkregen MPN-waarden voor denitrificerende bacteriën, gecombineerd met resultaten voor de verwijdering van nitraat, toonden aan dat er denitrificerende bacteriën aanwezig waren in het inoculum van een actiefslibsysteem, die werden begunstigd door de opgelegde voedingsomstandigheden.
De geïdentificeerde klonen hadden een fylogenetische verwantschap in de Proteobacteria fylum, Alphaproteobacteria en Gamaproteobacteria klasse, met Acidovorax sp, Acinetobacter sp., Comamonas sp. en ongecultiveerde bacteriën. Deze bacteriën zouden betrokken kunnen zijn bij de nitraatreductie en de consumptie van ethanol in een anoxische batchreactor.
ACHTERLIJKE MEDEDELINGEN
De auteurs zijn erkentelijk voor de subsidies ontvangen van FAPESP en CNPq.
APHA, AWWA en WEF, Standaardmethoden voor het onderzoek van water en afvalwater. 22e editie, American Public Health Association, Washington, DC (2005).
Iamamoto, C. Y., Nitrogen removal in sequencing batch reactor with suspended biomass treating high ammonia concentration wastewater. PhD Thesis, Universiteit van São Paulo, Brazilië, School of Engineering, Universiteit van São Carlos, Brazilië (2006).
Messing, J., New M13 vectors for cloning. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).
Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).