Differentiële effecten op membraanpermeabiliteit en levensvatbaarheid van humane keratinocyte cellen die megasonische velden van zeer lage intensiteit ondergaan

Het effect van de blootstelling aan zeer lage intensiteit US (Ispta tussen 7 en 16 mW/cm2, ruim onder de cavitatiedrempel, 100 mW/cm2) met een frequentie van 1 MHz werd bestudeerd op HaCaT-cellen. De experimenten werden uitgevoerd met een gelijkwaardige medische setup geschetst in figuur S1 van ESI, bij variërende behandeling parameters, zoals Ispta, duty cycle, en sonicatie tijd. Voorlopige experimenten wees uit dat, in het bereik van de blootstelling parameters hierin betrokken, de temperatuur constant bleef (binnen 1 ° C) met uitzondering van de thermische dissipatie van de US energie. Bovendien vertoonden de behandelingen geen significante afhankelijkheid van de bestudeerde effecten van de US-golf activiteitscyclus. Deze waarnemingen zijn consistent met de lage US-absorptie bij 1 MHz; integendeel, thermische effecten en duty cycle kunnen cellen en weefsels beïnvloeden die aan hogere frequenties worden blootgesteld, aangezien de US-verzwakkingscoëfficiënt evenredig is met de frequentie23,31.

Resultaten zullen in eerste instantie worden gepresenteerd met inachtneming van de twee relevante blootstellingsparameters, sonicatietijd en Ispta, afzonderlijk. De structurele en fysische veranderingen van het celmembraan (permeabiliteit, opname-efficiëntie en maximale grootte van de geïnternaliseerde moleculen) zullen worden geanalyseerd en gecorreleerd met de corresponderende cytotoxische schade en met de mogelijke activatie van ontstekingspatronen. Nadien zullen de resultaten geïnterpreteerd worden in termen van de sonicatiedosis, gedefinieerd als het product van de Ispta door de blootstellingstijd, namelijk de oppervlaktedichtheid van de akoestische energie die tijdens de sonicatie op het monster valt. In feite hangen de bestudeerde verschijnselen van deze grootheid af en dit stelde ons in staat een reeks van blootstellingsparameters te identificeren waarbij een voorbijgaande SP optreedt met verwaarloosbare biologische schade.

Analyse van de invloed van de US-blootstellingstijd

Wijzigingen in de membraanpermeabiliteit van HaCaT-cellen, veroorzaakt door 1 MHz US met lage intensiteit, werden geschat in termen van de opname-efficiëntie van de groene fluorescente probe calceïne. Aangezien intacte membranen ondoordringbaar zijn voor calceïne, is dit een betrouwbare marker voor SP. Het percentage groen-positieve cellen werd gekwantificeerd door flowcytometrie-analyses volgens paragraaf 2.5.

Om de gevoeligheid van de membraanpermeabiliteit voor de US-blootstellingstijd te evalueren, werd een zeer lage US Ispta gebruikt. Met name al een Ispta van 7 ± 1 mW / cm 2 significante effecten op de membraan permeabiliteit kan worden geactiveerd door de juiste belichtingstijden. Representatieve resultaten van parallelle flowcytometrie onderzoek op HaCaT en NIH-3T3 cellen zowel sonicated bij Ispta ~ 7 mW/cm 2 voor 5′, 15′, 30′ en 45′ worden getoond in Fig. 1 (rode driehoeken en blauwe vierkantjes, respectievelijk). Zoals verwacht resulteert de vergelijking tussen cellijnen na lage sonicatietijden (onder de drempel van sonoporatie) in een geringe affiniteit van calceïne, waarbij de verschillen (het grootst bij HaCaT-cellen) moeten worden verklaard door hun respectieve membraansamenstellings- en permeabiliteitskenmerken. Belangrijker is dat beide cellijnen een significante toename van de opname-efficiëntie vertonen vanaf 15′ blootstelling, wat overeenkomt met een sonicatiedosis van (6,3 ± 0,9) J/cm2, wat de activering van het SP-proces suggereert. Volgens de beste passingen van Fig. 1 wijzen onze experimenten bij langere blootstellingstijden op een lineaire correlatie tussen de opname-efficiëntie en de blootstellingstijd, met een identieke door US geïnduceerde opnamesnelheid in zowel HaCaT- als NIH-3T3-cellen (lineaire regressiehellingen (%/min) 1,3 ± 0,2, en 1,4 ± 0,2, voor respectievelijk HaCaT en NIH-3T3). Dit zou betekenen dat de toename van de opname-efficiëntie als gevolg van SP een cellijnonafhankelijk verschijnsel is.

Om het SP-proces verder te onderzoeken en de internalisatie te karakteriseren, werden behandelde HaCaT-cellen geëvalueerd met fluorescentiemicroscopie. In overeenstemming met de resultaten van de flowcytometrie vertonen monsters die gedurende 5′ werden gesoniseerd geen significante verandering in de membraanpermeabiliteit ten opzichte van het controlemonster (onbehandeld), terwijl vanaf 15′ een toenemende opname-efficiëntie wordt waargenomen (zie fig. 2 en figuur S2 van ESI), hoewel niet alle cellen fluorescentie vertoonden. Dienovereenkomstig lijken de cellen minder dicht en adherent ten opzichte van het controlemonster, wat wijst op een versoepeling van de tight-junctions. De representatieve beelden van Fig. 2 suggereren een heterogene lokalisatie van de calceïne binnen de cellen, en in feite kon met confocale fluorescentiemicroscopie binnen HaCaT-cellen duidelijk onderscheid worden gemaakt tussen de perifere distributie van de probe en de interne (zie beeld en 3D-reconstructies van Fig. 3). Verdere gedetailleerde beelden worden getoond in deel 3 van ESI. De waarnemingen zijn consistent met een opname van de fluoroprobe op twee niveaus: een perifere, waar de probe is gelokaliseerd in het endoplasmatisch reticulum netwerk rond het plasmamembraan; de andere, aanzienlijk tentoongesteld na 30′ blootstelling, waar de probe diffusie in het cytoplasma veroorzaakt een intense fluorescentie uniform verdeeld over de hele cel, met inbegrip van nucleoplasma. Opgemerkt moet worden dat Stokes diameter van calceïne ~ 1,36 nm is en zijn intranucleair transport niet wordt gehinderd door diffusieve barrières29. Uit een meer volledige analyse in de punten 3.2 en 3.3 kan worden geconcludeerd dat de US-blootstellingsdosis en het molecuulgewicht van de probe dominante factoren waren bij het bepalen van de opname.

Een andere test, gebaseerd op de rode PI-fluoroprobe, werd uitgevoerd om het herstel van de oorspronkelijke membraanpermeabiliteit van gesoniculeerde cellen te evalueren (zie ook punt 2.3). De internalisering van PI duidt op de activering van cytotoxische processen. De co-lokalisatie van de groene en rode kleurstoffen in de cellen wijst daarom op het falen van het membraanherstelproces na SP. Anderzijds wijst de waarneming in cellen van de groene fluorescentie in afwezigheid van de rode op het optreden van membraan SP tijdens de US-behandeling en het succesvolle herstel na het uitschakelen van het veld. Representatieve confocale fluorescentiebeelden worden getoond in Fig. 4. De co-lokalisatie van de twee kleurstoffen is afwezig in de cellen behandeld voor 15′, terwijl het nauwelijks wordt waargenomen na 30′ van de blootstelling (Figuur S5 van ESI). Consistent, een netto verlies van levensvatbaarheid van ~ 5% werd geopenbaard, zoals gecontroleerd door flowcytometrie. In de cellen die 45′ gesoniseerd werden, wat overeenkomt met een dosis van (19 ± 3) J/cm2, is de co-lokalisatie duidelijker (zie witte pijlen in Fig. 4B) en treedt een significanter verlies van levensvatbaarheid op (~10%, zoals gecontroleerd door flowcytometrie). Deze bevindingen suggereren dat een langere blootstellingstijd, overeenkomend met een hogere dosis bij een vast Ispta, een onomkeerbare verandering in de membraanstructuur induceert, gevolgd door een resulterende cytotoxische respons.

Analyse van de invloed van US-intensiteit

Het effect van het variëren van de intensiteit van het toegepaste US-veld op de membraanpermeabiliteit werd geanalyseerd op HaCaT-cellijn na 15′ blootstelling, kort genoeg om effecten uit te sluiten die door een langdurige sonicatie worden geïnduceerd. In onze studie lagen de intensiteiten tussen Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 en Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, ruim onder de cavitatiedrempel24. Volgens het in de punten 2.3 en 2.5 beschreven protocol werden met FITC gemerkte dextranen van verschillende MW (MW = 10, 40 en 70 kDa) gebruikt om voor elke US-intensiteit de inductie van membraanpermeabiliteit voor de verschillende molecuulgrootte te karakteriseren. Deze procedure maakt het op haar beurt mogelijk de grootte van de sonoporie te evalueren. Net als bij calceïne komen dextrans de onbehandelde cellen niet noemenswaardig binnen31,32, terwijl in het cavitatie US regime de celopname van FITC-gelabelde dextrans sterk kan worden verhoogd door zowel SP als door bevordering van de endosoomtransport30. In dit verband tonen de resultaten van de in Fig. 5 gerapporteerde flowcytometrie-metingen duidelijk een grootte-afhankelijke opname aan, een verschijnsel dat ons in staat stelt de gelijktijdigheid van actieve endocytose-effecten uit te sluiten en dat, volgens de literatuur22, de door een lage intensiteit gestimuleerde SP suggereert als het voornaamste mechanisme dat betrokken is bij het transport van dextraanmoleculen door het plasmamembraan. Meer bepaald wordt de waargenomen SP-geïnduceerde opname gekarakteriseerd door een drempel Ispta, die lineair toeneemt met de toename van het MW van de geïnternaliseerde moleculen. Onder deze drempel is de opname-efficiëntie van behandelde cellen vergelijkbaar met die van niet-blootgestelde cellen. De drempelwaarden voor Ispta zijn vermeld in tabel 1. Voor intensiteiten boven de drempelwaarde neemt de opname-efficiëntie toe met de toename van Ispta tot een maximum is bereikt. Voor de 10 kDa dextran neemt deze dan licht af tot een plateau. De waargenomen daling van de opname-efficiëntie bij hoge intensiteiten kan worden verklaard door de toename van het aantal dode cellen, die bij het spoelen uit het monster worden verwijderd en dus niet bijdragen tot de flowcytometrieanalyses. Bovendien zou de activering van apoptotische processen de internalisatie van de kleurstof kunnen belemmeren. Met name voor Ispta = 15 mW/cm 2 hoewel deze waarde veel lager is dan de cavitatie drempel, cellen zijn in staat om 70 kDa dextrans, met een Stokes diameter van ~ 12 nm internaliseren. Deze waarde kan worden genomen als een schatting van de minimale grootte van de sonoporiën geproduceerd in het membraan. In figuur S6 (deel 4 van ESI) wordt gerapporteerd een reeks representatieve fluorescentiebeelden vertonen de dextrans opname bij de drempel Ispta samen met de PI-test.

De internalisatie van PI wijst op een significante cytotoxische respons bij Ispta = 15 mW/cm2 (blootstellingsdosis 13,5 J/cm2). Zoals gerapporteerd door Udroiu et al.13 werd in vergelijkbare experimentele omstandigheden ook een lichte maar significante toename van micronuclei waargenomen in NIH-3T3 cellen, afhankelijk van de intensiteit en de tijd van blootstelling aan 1 MHz US. Deze waarnemingen suggereerden dat verdere studies nodig waren om de bio-effecten die gepaard gaan met membraan-SP beter te begrijpen, en daarom werd een studie uitgevoerd van de biologische respons van gesoniceerde cellen als functie van de US-intensiteit.

De biologische respons op de door SP veroorzaakte “membraanwonden” bij zeer lage US-intensiteit werd grondig gekarakteriseerd door de celdood te evalueren, met behulp van de gecombineerde AnnexinV- en PI-test die in paragraaf 2.5 wordt beschreven (zie ook paragraaf 5 van ESI). We evalueerden ook de expressie van het gen IL-6, een cytokine dat chronische ontsteking met kanker in verband brengt33,34. De resultaten van de flowcytometrie-analyse, uitgedrukt in celpercentages, worden gerapporteerd in Fig. 6. De levensvatbaarheid van de cellen blijft overwegend behouden (>90%) gedurende de 15′ behandelingen, maar vanaf Ispta = 9 mW/cm2 treedt een lichte daling op, vergezeld van een toename van de vroeg apoptotische cellen. Bij Ispta = 14 mW/cm2 een aanzienlijk percentage van necrotische cellen begint te worden waargenomen, terwijl bij Ispta = 16 mW/cm2 ook late apoptose bijdraagt tot celdood, in overeenstemming met een lichte vermindering van necrose (representatieve flowcytometrie stippen plots in figuur S7 van ESI). IL-6 genexpressie werd bepaald door RT-PCR (Fig. 7). Er werd geen up-regulatie waargenomen voor Ispta ≤15 mW/cm2 terwijl de behandeling bij 16 mW/cm2 een overexpressie van dit gen induceerde vergeleken met die van onbehandelde cellen.

Deze bevindingen suggereren dat, uitgaande van een Ispta-drempel van 16 mW/cm2 en 15′ sonicatie, de door US veroorzaakte membraanschade niet alleen de levensvatbaarheid van de cellen vermindert, maar ook, via de overexpressie van het aan ontsteking gerelateerde gen IL-6, een ontstekingsreactie zou kunnen induceren. Aangezien verschillende onderzoeken een rol hebben erkend van de ontsteking in het bevorderen van de pathogenese en de progressie van ziekten zoals kanker35,36, is verder onderzoek nodig om de aspecten met betrekking tot de ontstekingspatronen beter te karakteriseren.

Analyse van de invloed van de sonicatiedosis

Om de relatie tussen het toegepaste US-veld en de waargenomen biologische effecten kwantitatief te analyseren in termen van de energie die tijdens de blootstelling aan de cellen wordt afgegeven, werd de sonicatiedosis voor elke behandeling berekend als het product van de intensiteit Ispta door de blootstellingstijd. De verkregen waarden zijn vermeld in tabel 2, waar de waargenomen biologische effecten worden aangeduid met achtergrondkleuren. Onze resultaten suggereren dat de membraan SP optreedt vanaf een drempeldosis van ongeveer 6,3 J/cm2. Bovendien kan de grootte van de sonoporiën worden gerelateerd aan de sonicatiedosis. Bij doses hoger dan 10,8 J/cm2 wordt in de behandelde cel een afname van de levensvatbaarheid en gelijktijdige vroege apoptose waargenomen, gevolgd vanaf 14,4 J/cm2 door late apoptose, necrose en overexpressie van IL-6.

We willen benadrukken dat deze dosis, en Ispta 16 mW/cm2, overeenkomt met een negatieve piekdruk van ~ 0,02 MPa. Deze waarde lijkt hoog genoeg om mechanische spanning op het grensvlak tussen plasmamembraan en water te induceren, hoewel zij een orde van grootte lager ligt dan de tot dusver gesuggereerde drempelwaarde voor veiligheidsblootstelling (mechanische index ~0,2-0,3, bij 1 MHz).

Merk op dat onze experimenten met succes werden vergeleken met die welke werden uitgevoerd met behulp van een elektromedisch systeem dat daadwerkelijk wordt gebruikt bij VS-therapie (zie ook paragraaf 2.2), waardoor de medische relevantie van onze aanpak wordt onderstreept. In dit opzicht zijn wij ervan overtuigd dat het verstrekken van informatie over de sonicatiedosis (bij de vaste US-frequentie) een vollediger karakterisering van de celreactie op US-blootstelling mogelijk maakt en, op zijn beurt, een nauwkeurige identificatie van een reeks parameters waarbij voorbijgaande SP optreedt met verwaarloosbare biologische schade.

Een zeer belangrijke stap naar het begrijpen van de in vivo biologische impact van onze resultaten zou zijn om blootstelling aan US op driedimensionale biosystemen uit te voeren, zoals menselijke weefsels die bestaan uit multi-gestapelde cheratinocyten of uit endotheelcellen van de bloed-hersenbarrière.