Abstract
Met een steeds betere scheiding van complexe monsters en detectie van onbekend materiaal mogelijkheden, vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) is op grote schaal gebruikt in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) onderzoek. Dit artikel beschrijft de principes van vloeistofchromatografie (LC) en massaspectrometrie (MS) en hun voor- en nadelen bij kwalitatieve en kwantitatieve analyse van TCM. We hebben onderzoeksliteratuur opgezocht over de toepassing van LC-MS in TCM, gepubliceerd in de afgelopen vijf jaar in binnen- en buitenland. Om de analyse van TCM beter te begeleiden, richt dit overzicht zich vooral op de toepassingscategorie van LC-MS, hoe vaak verschillende soorten LC-MS gebruikt worden, en de kwalitatieve en kwantitatieve mogelijkheden van verschillende LC-MS in de studie van TCM.
1. Inleiding
Duizenden jaren van accumulatie van ervaring op het leven en ziekte gemaakt door onze voorouders eindelijk vertaald in een moderne apotheek. Chinese kruiden, met complexe en diverse ingrediënten, worden gewoonlijk op recept in de praktijk gebracht, volgens de regels van monarch, minister, assistent en gids. Bij de toepassing kan de hoeveelheid afzonderlijke kruiden en farmaceutische formuleringen variëren, wat kan leiden tot veranderingen in de interactie tussen de geneesmiddelen en het werkzame bestanddeel. Op verschillende plaatsen waar geneesmiddelen worden toegepast, zullen er verschillen zijn in de ingrediënten. Vanwege de complexiteit van de chemische samenstelling van TCM, kunnen verschillende chemische samenstellingen ook met elkaar reageren. Hoewel de praktische toepassing de effectiviteit van TCM heeft bewezen, is het in de moderne wetenschap nog steeds moeilijk om de specifieke geneesmiddel-actieve bestanddelen van TCM te verklaren. In de afgelopen jaren zijn het in vivo metabolisme en het werkingsmechanisme van een verbinding een belangrijk onderwerp van onderzoek in de Chinese geneeskunde geworden. Maar de kenmerken, zoals complexe samenstelling, mechanisme van multitarget en multimode van actie, en de rol van ingrediënten, geeft het onderzoek van TCM een zekere moeilijkheidsgraad.
LC-MS integreert volledig de hoge scheidingscapaciteit van het monster van LC voor complexe monsters en het sterke kwalitatieve vermogen van MS . Vanwege de hoge gevoeligheid en selectiviteit, LC-MS techniek is op grote schaal gebruikt in TCM onderzoek .
2. LC
Chromatografie scheidt het mengsel met behulp van de verschillen van de distributiecoëfficiënt tussen de twee fasen (mobiele en stationaire fase). Naar gelang van de toestand van de mobiele fase kan chromatografie worden onderverdeeld in gaschromatografie, vloeistofchromatografie en superkritische vloeistofchromatografie, terwijl naar gelang van de geometrische vormen van de stationaire fase chromatografie kan worden onderverdeeld in kolomchromatografie, papierchromatografie en dunne-laagchromatografie. De meest gebruikte LC-methode is kolomchromatografie, waarbij vloeistof als mobiele fase wordt gebruikt. High performance liquid chromatography (HPLC) is gemodificeerd op basis van de klassieke vloeistofkolomchromatografie.
De toepassing van LC wordt in twee categorieën onderverdeeld. Een ervan is kwalitatief of kwantitatief voor een bepaalde samenstelling. Kwalificatie wordt beheerd volgens de consistentie tussen het monster en de doelcomponent in de piektijd . Kwantificering wordt uitgevoerd volgens de standaardcurve die wordt gegenereerd nadat standaarden op verschillende concentratieniveaus zijn geïnjecteerd. De andere is een vingerafdruk die verwijst naar de notie dat, na de vingerafdruk monster is verwijderd op een bepaalde manier, kunnen we chromatogram of spectrogram gelabelde chemische kenmerken te verkrijgen door gebruik te maken van bepaalde methoden van analyse.
LC heeft een groot voordeel op het vermogen van het scheiden van complexe monsters, dus het is de meest effectieve optie wanneer toegepast op afzonderlijke mengsels, maar niet geschikt om structurele informatie van het materiaal te verkrijgen . Kwalificatie voltooid door het contrast tussen de piekposities van onbekende verbindingen en de normen is niet beschikbaar voor de controle van onbekende verbindingen.
3. MS
Massaspectrometrie wordt veel gebruikt op het gebied van TCM onderzoek vanwege de hoge selectiviteit, hoge gevoeligheid, en het vermogen van het verstrekken van informatie met inbegrip van relatieve moleculaire massa en structurele kenmerken. MS vervolledigt de kwalificatie met behulp van de moleculaire massa en relevante structurele informatie en vervolledigt de kwantificatie door de relaties van de piek en het gehalte aan verbindingen die de piek vertegenwoordigt. Bij atmosferische drukionisatie (API) van MS is er sprake van electrospray-ionisatie (ESI) en atmosferische drukchemische ionisatie (APCI) . Voor vele soorten verbindingen heeft ESI een hoge gevoeligheid. Vergeleken met ESI is APCI geschikt voor de minder polaire verbindingen en de analyse van vluchtige verbindingen. Afhankelijk van de verschillen tussen de gebruikte massa-analysatoren, worden de gebruikelijke MS afgesloten met quadrupool massaspectrum (Q-MS), time-of-flight massaspectrum (TOF-MS), en ion trap massaspectrometrie (IT-MS) .
Tandem massaspectrometrie verwijst naar twee of meer MS die samenwerken. De meest gebruikte tandemmassaspectrometrie is triple-quadrupool-massaspectrometrie (QQQ-MS). Om quadrupoles te gebruiken voor het uitvoeren van multistage massaspectrometrie, worden drie quadrupoles achter elkaar geplaatst, wat triple quadrupole is. Een ander type tandemmassaspectrometrie, zoals quadrupool-tijd-van-vluchtmassaspectrometrie (Q-TOF-MS) en quadrupool-ionenval tandemmassaspectrometrie (Q-IT-MS), bestaat ook uit een verscheidenheid van kwaliteitsanalysereeksen . Ion trap tijdreeksen kan bereiken multistage MS scans sequentieel op verschillende tijdstippen, zodat deze studie gecategoriseerd IT-MS als tandem massaspectrometer.
Tandem massaspectrometrie kan fragmenten van moleculaire ionen induceren die door eerste-fase MS zijn gegenereerd, op basis waarvan we de relatie tussen kind en ouder kunnen afleiden, structurele informatie van het molecuul kunnen verkrijgen en vervolgens de structuur van de verbinding kunnen suggereren, en de kwaliteitsanalyse voor bekende en onbekende verbindingen nauwkeuriger kunnen uitvoeren.
Hoewel MS structurele informatie van een materiaal kan verschaffen, vereist het een hogere zuiverheid van het monster. In TCM onderzoek, wordt het meestal gebruikt in combinatie met LC.
4. LC-MS
LC-MS techniek, met LC als scheidingssysteem en MS als detectiesysteem, bereikt uiteindelijk het spectrum. Wanneer LC en MS samenwerken, kunnen zij multistage MS uitvoeren om de structuur van de verbinding te speculeren, en zo de kwalitatieve en kwantitatieve analyse nauwkeuriger af te ronden.
Het terugvinden van de papers over LC-MS in de toepassing van TCM onderzoeksliteratuur gepubliceerd in de afgelopen vijf jaar in binnen- en buitenland, vonden we dat ze konden worden gescheiden in twee categorieën, dat wil zeggen, LC-Q-MS en LC-MS/MS. Om de verschillen en de voor- en nadelen van elke methode te analyseren, werden de papers ingedeeld volgens het verschil van tandem massaspectrometrie.
4.1. LC-Q-MS
LC-Q-MS kan worden gebruikt om kwalitatieve en kwantitatieve analyse uit te voeren voor standaard componenten, zoals weergegeven in tabel 1. Bij kwalitatieve analyse kunnen we structurele informatie verkrijgen door positieve of negatieve ionen te scannen. We kunnen ook duidelijk maken tot welke soort stof de chemische structuur behoort door deze te vergelijken met de standaardliteratuur . LC-Q-MS kwantificeert verbindingen op basis van de selectie van specifieke ionen voor monitoring . Bij gebrek aan standaarden, kan LC-Q-MS de kwalitatieve analyse voor de stof uitvoeren met behulp van sterke kwalitatieve eigenschappen van massaspectrometrie .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||
LC-Q-MS kan stoffen kwalitatief analyseren, maar sommige isomeren of stoffen met identiek molecuulgewicht moeten verder worden onderzocht, waarvan de structuren verder moeten worden geïdentificeerd door verwijzing naar meerfasige massaspectrometrie. Bovendien leidt een onnauwkeurige kwalitatieve analyse tot een vertekening van de kwantitatieve analyse.
4.2. LC-MS/MS
4.2.1. LC-IT-MS
IT-MS registreert ionen van verschillende kwaliteit door gebruik te maken van verschillende maten van RF-spanning die op de ringelektroden wordt toegepast. Het heeft een hoge gevoeligheid, en een enkele IT-MS kan multilevel massaspectrometrie functies te bereiken.
IT-MS kan tijdreeksen multistage MS scans te realiseren in verschillende chronologische orders, het verstrekken van ingrediënt MSn fragmentatie; dus, het is geschikt voor kwalitatieve materie, het verstrekken van structurele informatie voor de identificatie van onbekende samenstelling, zoals weergegeven in tabel 2. In de studie van TCM, LC-IT-MS wordt vaak gebruikt in kwalitatieve samenstelling .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.2. LC-QQ-MS
Triple quadrupole betekent dat drie quadrupoles ordelijk zijn geplaatst. Elke quadrupool heeft een afzonderlijke functie. Scan modes van triple quadrupole omvatten full-scan mode, product ion scan mode, parent ion scan mode, neutraal verlies scan mode, geselecteerde ion scan mode, en meerdere reacties monitoring scan mode.
LC-QQQ-MS wordt voornamelijk gebruikt voor kwantificering , zoals weergegeven in tabel 3. Sommige studies worden gebruikt voor de kwalificatie . Vergeleken met LC-Q-MS, kan LC-QQ-MS bepaalde ionen selecteren om te botsen en de fragmenten na de botsing analyseren. LC-QQ-MS kan het moederion en het dochterion tegelijkertijd ontdekken, zodat is het nauwkeurig, gevoelig, en uitvoerig. LC-QQQ-MS kan op een bredere waaier worden toegepast. Vergeleken met andere tandemmassaspectrometrieën heeft de triple quadrupole de beste kwantitatieve reproduceerbaarheid. LC-QQ-MS is de meest bekende kwantitatieve methode voor stoffen.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.3. LC-Q-TOF-MS
LC-Q-TOF-MS wordt over het algemeen gebruikt voor kwalificatie. Het heeft een hogere detectiegevoeligheid en massaresolutie. LC-Q-TOF-MS kan de massa nauwkeurig meten.
LC-Q-TOF-MS wordt hoofdzakelijk voor de kwalitatieve analyse van materialen gebruikt, zoals uit tabel 4 blijkt. Vergeleken met verscheidene andere tandem massaspectrometrieën, heeft het voordelen in opsporingsgevoeligheid, massanauwkeurigheid, en resolutie. Hoge resolutie en massanauwkeurigheid geven LC-Q-TOF-MS betere kwalitatieve mogelijkheden voor fragmentionen. Het is ook meer overtuigend bij het onderscheiden van ionen structuur en isomeren naast het ontleden onbekende structuren in deze methode .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5. Conclusies
Vergeleken met LC-MS en LC-MS/MS, wordt het onderzoek van LC-MS/MS relatief meer uitgevoerd, dat een hogere nauwkeurigheid van kwalitatieve analyse voor bekende en onbekende samenstellingen heeft. LC-IT-MS, vanwege de mogelijkheid van meerdere niveaus van massaspectrometrie, heeft een betere prestatie bij de beoordeling van een onbekende samenstelling structuur. LC-Q-IT-MS heeft een betere kwaliteit van resolutie dan LC-IT-MS. Vergeleken met de andere drie soorten LC-MS/MS, wordt LC-QQQ-MS vaker voor onderzoek gebruikt, met een beter kwantitatief vermogen dan de andere. Het kwalitatieve vermogen is goed, maar nog niet zo goed als LC-Q-TOF-MS. LC-Q-TOF-MS wordt hoofdzakelijk gebruikt voor de kwalitatieve analyse van materie. Sommige van zijn capaciteiten zijn relatief uitstekend, zoals de gevoeligheid voor detectie, de massanauwkeurigheid en de resolutie.
Qualitatieve methoden zijn verschillend bij de verschillende LC-MS methoden, terwijl de kwantitatieve methoden in principe hetzelfde zijn, omdat voor alle kwantitatieve methoden een standaard met verschillende concentraties nodig is. Kwantitatieve methoden worden gewoonlijk in twee verschillende typen onderverdeeld: de externe-standaardmethode en de interne-standaardmethode. Externe-standaardmethode betekent dat voor het uitvoeren van de kwantitatieve analyse eerst een standaardcurve wordt gegenereerd waarvan de horizontale as de concentraties voorstelt en de verticale as de oppervlakte van de kleurpiekspectra. Vervolgens kan op basis van het piekgebied een kwalitatieve analyse worden uitgevoerd. Interne-standaardmethode betekent dat de interne standaard met bekende concentratie eerst aan de oplossingen van het monster en de hybride referentiesubstantie wordt toegevoegd; dan wordt een standaardkromme gegenereerd waarvan de horizontale as de verhouding weergeeft tussen de concentratie van het referentiemonster en de concentratie van het interne-standaardmonster en de verticale as de verhouding weergeeft tussen het piekgebied van de standaard en het piekgebied van de interne standaard. Ten slotte wordt het interne-standaardmonster geïnjecteerd. Aan de hand van het piekgebied van de testindicatoren en de interne standaard kan een kwalitatieve analyse worden uitgevoerd.
In het onderzoek van TCM wordt geconcludeerd dat LC-Q-TOF-MS een betere keuze is voor kwalitatieve analyse, terwijl LC-QQ-MS beter blijkt te zijn voor kwantitatieve analyse. Kwantitatieve analyse wordt uitgevoerd met behulp van een specifieke standaard met een specifieke concentratie. Kwalitatieve analyse kan de structuur van sommige onbekende ingrediënten meten en speculeren over hun toeschrijving op basis van informatie uit bestaande onderzoeksliteratuur en databank. Standaardvalidatie is het nauwkeurigst voor kwalitatief materiaal. Vanwege de complexe samenstelling en onbekende capaciteiten van TCM, kunnen onderzoeksmethoden relatief nog niet aan de behoefte voldoen. Verder onderzoek en exploratie zijn nog steeds noodzakelijk.
Belangen
Alle auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81273925).