Wanneer een biostaal wordt gecryopreserveerd, vertragen de moleculaire beweging en de cellulaire processen tot het punt van glasovergang waar alle activiteit stopt, waardoor cellen, weefsels en zelfs hele organismen jarenlang worden bewaard. Het is dan ook geen verrassing dat cryopreservatie de kern vormt van de meeste moderne biobankingoperaties.
Maar ook al is het concept van invriezen rechttoe rechtaan, het fysieke proces is vrij complex. De manier waarop het invriezen of vitrificeren plaatsvindt, kan een dramatisch effect hebben op de levensvatbaarheid van cellen en de kwaliteit van monsters wanneer ze worden teruggebracht naar warmere temperaturen.
We zullen de fysieke eigenschappen van ijs en de belangrijkste gebeurtenissen bij het invriezen en ontdooien van monsters (wat net zo belangrijk is als koelen) onderzoeken in een reeks blogberichten die dieper ingaan op het invriesproces. In dit eerste bericht beginnen we bij het begin en kijken we naar de eerste stap van bevriezing, nucleatie.
Puur water dat tot onder het vriespunt wordt afgekoeld, kan een supergekoelde vloeistof blijven totdat het wordt verstoord. (Deze video hieronder geeft een goede illustratie van dit punt en is een geweldig wetenschappelijk experiment voor thuis met kinderen!)
In de video wordt op een waterfles geslagen, zodat zich ijskristallen kunnen vormen, of met andere woorden, een plaats voor nucleatie. Nucleatie is een proces waarbij de moleculen in een vloeistof zich beginnen te verzamelen tot kleine clusters, die zich zo rangschikken dat ze de kristalstructuur van de vaste stof bepalen. Er zijn twee soorten nucleatie:
- Heterogene nucleatie, die optreedt wanneer zich ijs begint te vormen rond een nucleatieplaats, zoals een fysische verstoring, een onzuiverheid (zoals zout) in de vloeistof of een onregelmatigheid in een vat. Aangezien biologische monsters nooit zuiver water zijn, treedt er altijd heterogene nucleatie op.
- Homogene nucleatie, die optreedt wanneer zich ijs vormt zonder een vooraf bepaalde nucleatieplaats. Zuiver water zal bevriezen bij ongeveer -39°C in afwezigheid van kernen. In de praktijk wordt homogene nucleatie echter niet vaak waargenomen vanwege de zeldzaamheid van volledig zuiver water.
Volgens een review in het tijdschrift Cryobiology, “is nucleatie van ijs de meest significificante ongecontroleerde variabele in conventionele cryopreservatie die leidt tot monster tot monster variatie in celherstel, levensvatbaarheid en functie.” De auteurs bevelen aan het nucleatieproces te beheersen en geven een lijst van verschillende invriesmethoden, waarvan er vele algemeen worden gebruikt voor IVF-toepassingen:
- Seeding: Het inbrengen van een extern ijskristal om de nucleatie bij een bepaalde temperatuur te bevorderen. Om besmettingsrisico’s te minimaliseren, wordt seeding nu gedaan door het genereren van een koude plek aan de buitenkant van het vat, zoals een koude tang aan de zijkant van een rietje.
- Chemische nucleanten: In het monstermedium worden ijs-nucleerende kristallen opgenomen. Chemische nucleanten zorgen voor een brede standaardisatie in verschillende soorten monsters, en zijn een actief gebied van onderzoek.
- Electrofreezing: Hoogspanning elektriciteit wordt gebruikt om ijsvorming induceren.
- Mechanische methoden: Schudden, tikken of het toepassen van ultrageluid kan effectief zijn voor nucleatie, maar moeilijk te standaardiseren.
- Schokkoeling/gecontroleerd snelvriezen: Het blootstellen van het monster aan een snelle reeks temperatuurstijgingen kan nucleatie bevorderen. Dit is wat een gecontroleerde snelheid vriezer doet door het begeleiden van monsters door het nucleatieproces.
- Drukverschuiving: Nucleatie kan worden geïnduceerd door het monster onder druk te zetten, de temperatuur te verlagen en vervolgens de druk los te laten.
Voor een uitstekende inleiding op de eigenschappen van ijsvorming in biologische systemen en meer over het proces van nucleatie, bekijk hoofdstuk één van de baanbrekende tekst uit 2004 “Life in the Frozen State,” een sterk aanbevolen lectuur voor iedereen die geïnteresseerd is in meer gedetailleerde kennis over deze processen.