dNTP staat voor desoxyribose nucleotide trifosfaat dat in PCR wordt gebruikt om de groeiende DNA streng uit te breiden. dATP, dTTP, dGTP en dTTP zijn vier veel voorkomende dNTPs die in PCR worden gebruikt.
De functie van dNTPs in PCR is om de groeiende DNA streng uit te breiden met behulp van Taq DNA polymerase. Het bindt zich met de complementaire DNA-streng door waterstofbruggen.
De PCR is een in vitro techniek van DNA-synthese. Het doel van het uitvoeren van PCR is het genereren van meerdere kopieën van DNA fragmenten van onze interesse om het te visualiseren onder de gelelektroforese.
Het doel van PCR is miljoenen DNA-kopieën te maken voor verschillende downstream-toepassingen zoals DNA-sequencing of DNA-microarray.
De polymerase-kettingreactie is het ongeëvenaarde instrument dat sinds zijn ontdekking in het moleculair genetisch onderzoek wordt gebruikt. DNA-sjabloon, primers, buffer, Taq DNA-polymerase en dNTPs zijn de ingrediënten van PCR. Om het mechanisme van PCR te begrijpen moeten we het belang van elk ingrediënt dat erin wordt gebruikt leren,
In dit artikel bespreken we een van de belangrijkste ingrediënten van PCR, namelijk de dNTPs. We zullen ook kijken naar de structuur ervan en waarom het zo belangrijk is.
Verder zullen we het ook hebben over het mechanisme van de interactie van dNTPs en Taq DNA polymerase en hun werking op de groeiende DNA streng.
Verder zullen we het hebben over het mechanisme van hoe dNTPs en DNA polymerase op elkaar inwerken en helpt om de DNA streng te laten groeien.
Lees verder over PCR gerelateerde artikelen,
- Rol van DMSO in PCR: DMSO een PCR versterker
- Functie van taq DNA polymerase in PCR
- Richtlijnen voor het ontwerpen van PCR-primers
- Rol van MgCl2 in PCR-reactie
Key Topics:
Wat zijn dNTPs?
De dNTPs zijn de kunstmatige nucleotiden die in de PCR worden gebruikt om nieuwe DNA-strengen te synthetiseren, ongeveer zoals bij DNA-replicatie. dATP, dTTP, dGTP, dTTP zijn veelvoorkomende nucleotiden die in de PCR-mastermix aanwezig zijn.
Structuur van dNTPs:
De dNTP staat voor desoxyribose nucleotide trifosfaat.
Vooreerst moeten we verschillende basistermen begrijpen, zoals base, nucleotiden, nucleosiden, ribonucleotiden, desoxyribonucleotiden, dideoxyribonucleotiden, om dNTPs te kunnen begrijpen. Dit zijn enkele basistermen die routinematig in de genetica worden gebruikt, maar toch hebben mensen het verkeerd begrepen.
Adenine en Guanine zijn Purine basen, terwijl Cytosine en Thymine Pyrimidine basen zijn. Stikstofhoudende basen kunnen niet direct DNA vormen. Fosfaat ruggengraat en pentose suiker zijn bovendien nodig om een DNA molecuul te vormen.
De nucleotide is opgebouwd uit een pentose suiker, fosfaat en stikstofhoudende basis. Een nucleotide bindt zich met een andere aangrenzende nucleotide met fosfodiesterbinding, terwijl een nucleotide zich met een andere nucleotide op de tegenoverliggende DNA-streng bindt met waterstofbruggen.
De afbeelding geeft de structuur weer van desoxyribose trifosfaat, difosfaat en monofosfaat.
Lees verder over de structuur van DNA: DNA verhaal: De structuur en functie van DNA
Het in de nucleotide aanwezige fosfaat is trifosfaat, (tri-drie) Wanneer het fosfaat niet met de nucleotide is verbonden (of afwezig is), wordt het een nucleoside genoemd (nucleotide zonder fosfaat wordt nucleoside genoemd).
Wanneer een waterstofatoom de hydroxylgroep in de pentose suiker vervangt, wordt de suiker een deoxysuiker genoemd. Het DNA is opgebouwd uit deoxy pentose suiker, terwijl het RNA is opgebouwd uit de enige ribose suiker.
De dNTPs zijn de keten van nucleotiden die zijn opgebouwd uit ribose, stikstof base en fosfaat.
Verder zijn ddNTPs verschillend van dNTPs.
Dideoxynucleotide trifosfaat heeft geen vrije 3′ OH groep, een andere 3′ OH groep van suiker is vervangen door waterstof.
Daarom kan het niet de uitbreiding van een groeiende DNA streng veroorzaken. Deze typen ddATP, ddTTP, ddCTP en ddGTP worden dus gebruikt bij DNA-sequencing. We zullen de rol van ddNTPs bij sequencing in een ander artikel uitvoerig bespreken.
De ddNTPs worden gebruikt in de ketenbeëindigingsmethode om de uitbreiding van de DNA-synthese te stoppen.
De afbeelding geeft het verschil weer tussen ribose suiker, desoxyribose suiker en desoxyribose suiker.
Het trifosfaat bestaat uit drie verschillende fosfaatmoleculen die een ruggengraat vormen voor het DNA.
De fosfaatruggengraat van DNA heeft drie verschillende fosfaatmoleculen die alfa-, bèta- en gammafosfaat worden genoemd. Wanneer één fosfaat of gammafosfaat vrijkomt, wordt de structuur deoxynucleotide-difosfaat genoemd.
Zo ook wanneer twee van de drie fosfaten vrijkomen, wordt de structuur deoxynucleotide-monofosfaat genoemd.
dATP en dGTP zijn purines, terwijl dCTP en dTTP pyrimidine dNTPs zijn die in PCR-reacties worden gebruikt. De functie van dNTPs in PCR is dezelfde als in vivo replicatie. Als u geïnteresseerd bent om de verschillen te lezen tussen nucleotiden vs nucleosiden en purines vs pyrimidines lees dan deze artikelen:
- Purines vs Pyrimidines
- Nucleotiden vs Nucleosiden
De afbeelding stelt vier verschillende dNTPs structuur voor.
De functie van dNTPs:
De dNTPs zijn de ingrediënten van PCR, RT-PCR, DNA-sequencing of DNA-microarray die helpt bij de groei van het DNA of de amplificatie van DNA.
Werkingsmechanisme:
Het proces van PCR is verdeeld in drie temperatuurafhankelijke stappen:
- Denaturatie
- Annealing
- Extensie.
In de denaturatiestap wordt het dubbelstrengs DNA gedenatureerd tot enkelstrengs DNA; in de annealingstap bindt de primer op de exacte plaats waar zijn complementaire sequentie aanwezig is en,
In de extensiestap voegt het Taq DNA-polymerase de dNTPs toe aan de groeiende DNA-streng.
Als de streng eenmaal is geopend en de primer zich bindt aan het enkelstrengs DNA, begint het Taq DNA-polymerase met zijn katalytische activiteit.
Het Taq DNA-polymerase gebruikt het enkelstrengs DNA als substraat voor de enzymatische activiteit en vestigt zich op de primer-DNA-verbinding.
Het ene uiteinde van het Taq DNA polymerase bindt zich nabij de 3′ OH groep van de oligonucleotide primer, dit complex wordt P- DNA complex genoemd.
De afbeelding stelt de structuur van DNA voor met waterstofbruggen en de fosfodiësterbinding van DNA.
In de volgende stap is de dNTP-additie begonnen.
Het dNTP bindt met het P-DNA complex met zwakke affiniteit als de exacte complementaire nucleotide aanwezig is. Spoedig daarna houdt het Taq DNA-polymerase het vast en ontstaat de waterstofbruginteractie tussen complementaire base en dNTP.
Hier beslist in het begin niet de gehele nucleotide, maar de base (stikstofhoudende base) die op het dNTP aanwezig is, of het bindt of niet.
Voreerst, als het de complementaire base op het sjabloon ssDNA vindt (A voor T en G voor C), zal het de waterstofbruggen tussen hen vormen. Er worden drie waterstofbruggen tussen C en G en twee waterstofbruggen tussen A en T gevormd.
Nadat de waterstofbrug zich vormt, brengt het Taq DNA-polymerase die binding van dNTP met de groeiende DNA-streng tot stand door een fosfodiesterbinding te vormen. Na de vorming van de fosfodiesterbinding gaat het Taq DNA-polymerase een stap verder om nieuw dNTP toe te voegen.
De fosfodiesterbinding wordt gevormd tussen 3′ OH van de primer en 5′ P van het dNTP.
Na de vorming van de waterstofbrug katalyseert het Taq DNA-polymerase de reactie door het gamma- en betafosfaat uit het trifosfaat van het dNTP te verwijderen. Twee pyrofosfaten (PPi) komen vrij na de voltooiing van de reactie.
De exacte kinetiek van hoe de dNTPs en Taq polymerase tijdens de PCR-reactie op elkaar inwerken is nog steeds niet bekend.
Lees verder over een agarose gel electroforese,
- Agarose gel electroforese
- DNA gel loading dye
- Rol van EtBr in agarose gel electroforese
De concentratie van dNTPs in PCR:
In het algemeen, voor PCR reactie met 30 tot 35 cycli van een run, 200μM van elke dNTPs zijn voldoende.
200μM elk, wat betekent dat een totaal van 800μM van 4 dNTP’s mengsels wordt gebruikt in een enkele PCR-reactie. We moeten onze werkconcentratie bereiden uit de voorraadoplossing van 100mM.
De laatste tijd is kant-en-klare mastermix echter zeer populair en effectief. De gebruiksklare mastermix bevat alle belangrijke ingrediënten zoals dNTPs mix, gel loading kleurstof en Taq DNA polymerase.
Als wetenschapsstudent moeten we ons afvragen hoe we de werkoplossing uit de voorraad kunnen bereiden. Stel dat we 2 mM moeten bereiden uit de voorraad van 100 mM.
nu,
Weetje nog dat V1C1= V2C2?
Hier is de gegeven concentratie C1 is 100mM (dat is de voorraadconcentratie van dNTPs)
V1 is het gegeven volume is onbekend (?)
C2 is de benodigde concentratie = 2mM
V2 is het benodigde volume= 1000μL
Nu V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Hier, 20μL van elke dNTPs nodig voor de voorbereiding van de werkoplossing, zodat het uiteindelijke volume voor onze mix is 80μL van (dATP, dCTP, dGTP en dTTP) in 920μL van D / W.
Dit maakt de uiteindelijke concentratie van 2mM van elke dNTP in 1000μL van de werkoplossing. Bereken zelf voor 200μM.
Mijn ultieme gids voor het gebruik van dNTP’s in PCR
Gebruik altijd twee buisjes voorraadoplossing en bewaar alle buisjes bij -20°C.
Bereken hoeveel reacties u in een week uitvoert, bereid dienovereenkomstig de werkoplossing uit de voorraad en bewaar die bij 4°C. Omdat herhaald invriezen en ontdooien de activiteit van dNTPs zal verminderen.
Draag altijd gloeikousjes en zorg voor steriele omstandigheden tijdens het bereiden van de werkoplossing, omdat verontreiniging van vreemd DNA de PCR-reactie zal hinderen.
De concentratie van 200μM is voldoende voor de PCR-reactie, maar voor PCR over lange afstanden kan 2mM tot 3 mM concentratie van elk dNTP worden gebruikt.
Als de concentratie van dNTPs toeneemt, zal de snelheid van niet-specifieke binding toenemen. Evenzo leidt de schaarste aan dNTP’s tot onvolledige PCR-producten. Gebruik dus altijd een geschikte hoeveelheid dNTPs.
Conclusie:
Conclusief, De functie van dNTPs in PCR reactie is even belangrijk als Taq DNA polymerase.
Met de hulp van Taq binden de dNTPs zich aan de groeiende DNA-streng en breiden die uit. Als u niet met al deze dingen wilt knoeien, kunt u gebruik maken van een kant-en-klare PCR-kit, die meer de voorkeur verdient. Toch moet je de manuele methode van reagensbereiding leren.