Bookshelf

De belangrijkste enzymen bij de biosynthese van neuropeptiden zijn endoproteasen, exoproteasen en enzymen die de uiteinden van de peptiden modificeren. De ontdekking en karakterisering van Kex2p, het endoprotease dat pro-α-koppelfactor van gist splitst om vier kopieën van het feromoon α-koppelfactor te produceren (fig. 18-2), vormden de sleutel tot de ontdekking van de prohormoonconvertases van zoogdieren, waaronder furine, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC, en PACE4 . De prohormoonconvertases delen homologie met bacteriële subtilisines en hebben een Asp-His-Ser katalytische triade, die bestaat uit drie sleutelaminozuren die betrokken zijn bij de katalyse (aangeduid met D, H, en S in fig. 18-5). De proregio van elk (fig. 18-5) moet tijdens de biosynthese aanwezig zijn om het protease correct te laten vouwen, maar moet worden verwijderd om een geactiveerd protease te verkrijgen. Voor PC1 en furine gebeurt de verwijdering van het proregion binnen enkele minuten na de biosynthese, terwijl het enzym zich in het endoplasmatisch reticulum bevindt, en is het waarschijnlijk een autokatalytisch proces. Bij de andere prohormoonconvertases verloopt de verwijdering van het proregion veel langzamer. Expressie van actief PC2 vereist coëxpressie van het peptide 7B2 (fig. 18-5), dat een chaperonfunctie lijkt te hebben en ook expressie van de endoproteolytische activiteit van PC2 kan voorkomen totdat PC2 in secretorische granules is gedeponeerd. Voor de andere prohormoonconvertases is geen overeenkomstig chaperon/remmer-peptide geïdentificeerd.

De zoogdier-endoproteasen die het duidelijkst betrokken zijn bij de verwerking van neuropeptiden zijn PC1 en PC2, Ca2+-afhankelijke proteasen die worden aangetroffen in secretorische granules waarvan de expressie beperkt is tot neuronen en endocriene cellen (Fig. 18-5). Verscheidene andere leden van deze endoprotease-familie komen op grotere schaal tot expressie, terwijl weer andere tot expressie komen op beperkte plaatsen die verschillen van neuronen en endocriene cellen. Zo wordt furine in vrijwel alle cellen aangetroffen en is het voornamelijk gelokaliseerd in het trans-Golgi-netwerk; furine katalyseert splitsingen die belangrijk zijn voor de werking van peptiden, zoals de initiële splitsing van de ELH-, zenuwgroeifactor- en parathyroïdehormoonprecursors, alsmede splitsing binnen de insulinereceptorprecursor om de actieve αβ-dimeervorm van de receptor te produceren. Furine kan ook een rol spelen bij de activering van sommige van de andere verwerkingsenzymen, zoals PC2 en CPE.

PC1 en PC2 klieven bij geselecteerde paren basische aminozuren in peptideprecursoren: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys en Arg-Lys. PC1 kan ook splitsingen katalyseren op de geselecteerde enkelvoudige Arg-plaatsen in sommige precursors, zoals prosomatostatine en procholecystokinine. De splitsing in LDCV’s door PC’s wordt strak gecontroleerd en verloopt vaak op een zeer geordende manier (fig. 18-6). De eerste splitsingen van POMC vinden plaats in minder dan 1 uur (fig. 18-6, stappen 1 en 2), terwijl andere splitsingen pas na enkele uren plaatsvinden (fig. 18-6, stappen 6 en 7). De endoproteolytische splitsing van propeptiden is vaak de snelheidsbeperkende reactie in de biosynthese van peptiden.

Figuur 18-6

De verwerking van de pro-opiomelanocortine (POMC) precursor verloopt op een geordende, stapsgewijze wijze. Splitsing van de POMC precursor vindt plaats op zeven plaatsen, waarbij sommige reacties weefselspecifiek zijn. De omcirkelde nummers geven de tijdsvolgorde van (meer…)

Het patroon van splitsingen gekatalyseerd door PC1, PC2 en furine wanneer uitgedrukt in neuronen en endocriene cellen is veel selectiever dan het patroon van splitsingen gezien in reageerbuis-tests met gezuiverde enzymen. Bijvoorbeeld, hoewel prohormoonconvertases gewoonlijk splijten aan de COOH-terminus van een paar basische residuen in modelpeptidesubstraten, kunnen de splijtingen in cellen in het midden van de paren basische residuen plaatsvinden, zoals in het geval van de splitsing van POMC (fig. 18-6), waar de basische residuen gescheiden zijn en bij de twee resulterende rijpe peptiden blijven. Het is waarschijnlijk dat de Ca2+ concentratie en de interne pH van LDCVs twee variabelen zijn die door neuronen en endocriene cellen worden gebruikt om de endoproteolytische activiteit in LDCVs te reguleren.

Er kan worden aangetoond dat ook andere endoproteasen een rol spelen bij de biosynthese van neuropeptiden. Vooraanstaande kandidaten zijn de homoloog van het aspartylprotease-3 (YAP-3) uit gist en het N-arginine dibasisch (NRD) convertase. Een bijkomende wending in de biosynthese van peptiden wordt waargenomen in het hart, waar proatriale natriuretische factor (proANF) wordt opgeslagen in LDCV’s en het rijpe ANF uit atriale cellen wordt vrijgemaakt in de circulatie. Bij de verwerking van proANF, die splitsing na een enkel Arg-residu in proANF inhoudt, kunnen PC1 of PC2 niet betrokken zijn, aangezien er verwaarloosbare hoeveelheden van deze PC’s in het hart aanwezig zijn.

CPE is een oplosbaar eiwit dat in vrijwel alle LDCV’s in neuronen en endocriene cellen wordt aangetroffen (fig. 18-5) . Het verwijdert basische residuen, Lys of Arg, van de COOH termini van peptide tussenproducten geproduceerd door de prohormoon convertases. Het werd oorspronkelijk geïdentificeerd door zijn weefseldistributie en substraatspecificiteit, samen met zijn specifieke remming door guanidinoethylmercaptosuccininezuur (GEMSA). CPE is een Co2+- en Zn2+-geactiveerd enzym met een kort proregion dat normaliter tijdens de rijping van het enzym wordt verwijderd; in tegenstelling tot de prohormoonconvertases is CPE actief met het aangehechte proregion. De carboxypeptidasefunctie bij de verwerking van peptiden is normaal gesproken niet snelheidsbeperkend, aangezien peptide-tussenproducten met COOH-terminale basische residuen slechts bij uiterst lage concentraties in weefsel- of LDCV-extracten worden gedetecteerd. Onlangs zijn nog andere carboxypeptidasen geïdentificeerd, met name CPD, een integrale membraanvorm van het enzym met 3 carboxypeptidasedomeinen. Het relatieve belang van CPE en deze extra carboxypeptidasen voor de verwerking van neuropeptiden in vivo is onduidelijk. Aangezien splitsing bij een paar basische residuen in het midden van het paar kan plaatsvinden, is er goede reden om aan te nemen dat in LDCV’s een aminopeptidase zal worden aangetroffen.

PAM is een bifunctioneel enzym dat in bijna alle LDCV’s wordt aangetroffen (fig. 18-5) . PAM werkt op peptidesubstraten na endoproteolytische splitsing en exopeptidasewerking, wanneer een COOH-terminaal Gly-residu is blootgelegd, en zet het peptidyl-Gly om in het overeenkomstige peptide-NH2. Ongeveer de helft van de bekende bioactieve peptiden zijn α-geamideerd, en α-amidatie is over het algemeen van cruciaal belang voor de biologische werkzaamheid. De peptidyl-Gly en peptide-COOH vormen zijn gewoonlijk inactief bij fysiologische concentraties. De eerste stap van de α-amidatie wordt uitgevoerd door peptidylglycine α-hydroxylerend mono-oxygenase (PHM), dat het NH2-terminale gedeelte is van het bifunctionele PAM-eiwit. PHM bindt twee Cu2+ atomen die deelnemen aan de katalyse door cycli van reductie en oxidatie te ondergaan. PHM gebruikt ascorbinezuur als reductiemiddel, waarbij één zuurstofatoom van O2 in het peptide wordt opgenomen tijdens de hydroxylatiestap. Het PHM vertoont dus enzymatisch veel overeenkomst met dopamine β-mono-oxygenase (DBM), dat dopamine omzet in noradrenaline (zie hoofdstuk 12). De tweede stap van de α-amidatie reactie wordt uitgevoerd door een tweede enzymatisch domein van PAM, peptidyl-α-hydroxyglycine α-amidating lyase (PAL). Het PAL-domein is een nieuw, divalent metaalion-afhankelijk enzym. Neuronen brengen voornamelijk een integrale membraanvorm van het bifunctionele PAM-eiwit tot expressie (fig. 18-5), terwijl een extra mRNA-splitsing sommige endocriene cellen in staat stelt om oplosbare versies van het eiwit tot expressie te brengen, waarin het transmembraandomein ontbreekt. Bij de integrale membraanvormen van PAM strekt het korte COOH-terminale domein zich uit tot in het cytoplasma en neemt het deel aan de geleiding van PAM tussen LDCV’s en het celoppervlak. De aanvoer van gereduceerd ascorbaat in LDCV’s wordt in stand gehouden door cytochroom B561, een eiwit dat vijf transmembraandomeinen heeft en elektronen van cytosolisch ascorbaat naar ascorbaat in het lumen van de LDCV’s transporteert. Cytochroom B561 wordt ook aangetroffen in catecholaminebevattende blaasjes, waar het een soortgelijke functie vervult voor DBM (zie hoofdstuk 12). Zenuw- en endocriene weefsels handhaven concentraties van gereduceerd ascorbaat ongeveer 100-voud boven de bloedconcentratie van ascorbaat, terwijl de meeste andere weefsels geen ascorbaat concentreren.

Elke peptiden hebben NH2-terminale pyroglutaminezuur residuen, ook wel cyclisch glutaminezuur (<Glu) genoemd, die essentieel zijn voor de bioactiviteit, bijvoorbeeld thyrotropin-releasing hormone (TRH) en gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Het enzym dat verantwoordelijk is voor deze stap is glutaminyl cyclase, dat het oorspronkelijke NH2-terminale Gln omzet in <Glu. De regulatie en functie van glutaminyl cyclase is nog niet uitvoerig bestudeerd. Een andere belangrijke maar niet vaak voorkomende modificatie van peptiden is α-N-acetylering (Fig. 18-6 en 18-7). Tijdens de verwerking van POMC verhoogt α-N-acetylering de potentie van ACTH(1-13)NH2 om de huid donkerder te maken aanzienlijk, terwijl zowel de adrenale steroidogene potentie van ACTH als de opiaatactiviteit van β-endorfine worden opgeheven. Het enzym dat verantwoordelijk is voor deze modificatie is nog niet gezuiverd of gekloond.

Figuur 18-7

Celspecifieke verpakking van peptiden in grote dichte kernblaasjes kan leiden tot zeer verschillende patronen van peptidesecretie. Sorteren van neuropeptiden in verschillende rijpe secretorische korrels (MSG) wordt getoond voor zak cel neuronen, maar niet optreedt voor endocriene (meer…)

Als voorbeeld, figuur 18-6 toont het patroon van de verwerking stappen in het POMC-systeem . De eerste endoproteolytische stappen (fig. 18-6, stappen 1-4) worden gemedieerd door PC1 en komen voor in alle POMC-producerende neuronen en endocriene cellen, gewoonlijk in de getoonde numerieke volgorde. Het is duidelijk dat stap 1 en 2 in het trans-Golgi-netwerk worden gestart en in LDCV’s worden voortgezet, terwijl stap 4 alleen in LDCV’s plaatsvindt. Stappen 5-7 komen alleen voor in LDCV’s en lijken PC2 te vereisen. In de volwassen voorste hypofyse bevatten de corticotrofen PC1 maar geen PC2 en voeren ze alleen de splitsingen 1-4 uit. Tijdens de vroege postnatale ontwikkeling brengen corticotropen echter ook PC2 tot expressie en worden de splitsingen 5-7 tijdelijk gezien in corticotropen. Bij de rat nemen de expressie van PC2 en de splitsing binnen ACTH (splitsing 5) gelijktijdig af enkele weken na de geboorte, ongeveer op het moment dat het volwassen patroon van ACTH-controle over de bijniersteroidogenese verschijnt.

Melanotropen en neuronen van het CZS die POMC maken, brengen zowel PC1 als PC2 tot expressie, zodat de kleinere peptideproducten in deze cellen worden gezien. PAM komt tot expressie in alle POMC-producerende cellen, zodat de α-amidatie van verbindingspeptide (JP), een klein peptide zonder duidelijke biologische functie, snel in alle POMC-cellen optreedt (fig. 18-6). In de melanotrope cellen van de tussenliggende hypofyse en de POMC-neuronen van de nucleus van het solitaire tractus treedt α-N-acetylering van ACTH(1-13)NH2 en β-endorfine op. In melanotropen kan α-N-acetylering van ACTH plaatsvinden vóór splitsing 5. Zoals in figuur 18-4 is aangegeven, bepalen de specifieke splitsingen en de modificaties van de NH2- en COOH-termini van de peptideproducten het mengsel van vrijgekomen bioactieve peptiden.