Abstract
Amniotisch vocht (AF) en amniotisch membraan (AM) zijn recent gekarakteriseerd als veelbelovende bronnen van stam- of progenitorcellen. Beide bevatten niet alleen subpopulaties met stamcelkenmerken die lijken op die van volwassen stamcellen, zoals mesenchymale stamcellen, maar vertonen ook een aantal embryonale stamcelkenmerken zoals (i) expressie van pluripotente merkers, (ii) hoge expansie in vitro, of (iii) multilineage differentiatiecapaciteit. Recente inspanningen zijn gericht geweest op de isolatie en gedetailleerde karakterisering van deze stamceltypes. Echter, variaties in hun fenotype, hun heterogeniteit beschreven door verschillende groepen, en de afwezigheid van een enkele merker die enkel in deze cellen tot expressie komt, kunnen de isolatie van een zuivere homogene stamcelpopulatie uit deze bronnen en het potentiële gebruik van deze cellen in therapeutische toepassingen verhinderen. In dit artikel willen we een overzicht geven van de recente vooruitgang in het ontdekken van merkers voor stamcellen afkomstig van foetale bronnen zoals AF en AM, gebruikmakend van nieuwe methodologieën gebaseerd op transcriptomics, proteomics, of secretoomanalyses.
1. Inleiding
Zowel amnionvocht (AF) als amnionmembraan (AM) vertegenwoordigen rijke bronnen van stamcellen die in de toekomst kunnen worden gebruikt voor klinische therapeutische toepassingen. Ethische bezwaren tegen het isoleren van stamcellen uit deze bronnen worden tot een minimum beperkt, in tegenstelling tot de problemen die rijzen bij het onderzoek aan menselijke embryonale stamcellen (ESC). AF wordt verzameld tijdens geplande vruchtwaterpuncties tussen de 15e en 19e week van de zwangerschap voor prenatale diagnose en het teveel aan monster kan worden gebruikt voor het winnen van cellen, terwijl AM gewoonlijk wordt verzameld tijdens de keizersnede van voldragen zwangerschappen. Gezien de heterogeniteit van de stamcelpopulaties die uit deze bronnen afkomstig zijn, is de isolatie van specifieke celtypes moeilijk en is een gedetailleerde fenotypische en moleculaire karakterisering van de respectieve cellen vereist. Studies die omics benaderingen omvatten zijn fundamenteel voor een beter begrip van de mechanismen van moleculaire expressie van deze cellen en voor het definiëren van de juiste methodologieën voor hun isolatie, voorafgaand aan hun gebruik in therapeutische benaderingen.
Dit artikel heeft tot doel de belangrijkste biologische en moleculaire karakteristieken van AF- en AM-afgeleide stamcellen te presenteren en ook de recente vooruitgang te belichten in de ontdekking van merkers met behulp van globale methodologieën, zoals transcriptomics, proteomics of secretoomanalyses.
1.1. Vruchtwater
AF fungeert als een beschermende vloeistof voor het zich ontwikkelende embryo en biedt mechanische ondersteuning en de nodige voedingsstoffen tijdens de embryogenese . Amniocentese wordt al vele decennia gebruikt als een routineprocedure voor karyotypering van foetussen en prenatale diagnose, waarmee een verscheidenheid aan genetische ziekten kan worden opgespoord.
Het belangrijkste bestanddeel van AF is water; de totale samenstelling varieert echter tijdens de zwangerschap. Aan het begin van de zwangerschap is de osmolariteit van het vruchtwater gelijk aan die van het foetale plasma. Na keratinisatie van de foetale huid daalt de amniotische osmolariteit ten opzichte van het maternale of foetale plasma, voornamelijk als gevolg van de instroom van foetale urine. Interessanter is dat AF ook een rijke bron is van een stamcelpopulatie die afkomstig is van de foetus of het omringende amnionmembraan. Aanvullend onderzoek door verschillende groepen is recentelijk gericht geweest op de cellulaire eigenschappen van amnioncellen en hun potentieel gebruik in preklinische modellen en in transplantatietherapieën. Amniotic Fluid Stem Cells (AFSCs)
De amniotic fluid cells (AFCs) vertegenwoordigen een heterogene populatie afkomstig van de drie kiemlagen. Deze cellen hebben een epitheliale oorsprong en zijn afkomstig van hetzij het zich ontwikkelende embryo, hetzij de binnenzijde van het amnionmembraan; zij worden gekarakteriseerd als amnionmembraanstamcellen. De AFC’s bestaan hoofdzakelijk uit drie groepen adherente cellen, die worden gecategoriseerd op basis van hun morfologische, groei- en biochemische kenmerken. Epithelioïde (E-type) cellen zijn kuboidale tot zuilvormige cellen afkomstig van de foetale huid en urine, amnionvloeistofcellen (AF-type) zijn afkomstig van foetale membranen, en fibroblastische (F-type) cellen worden voornamelijk gegenereerd uit vezelig bindweefsel. Zowel AF- als F-type cellen hebben een fibroblastoïde morfologie en het dominante celtype lijkt het AF-type te zijn, dat keratines en vimentines coëxpresseert. Verschillende studies hebben aangetoond dat menselijke amnionvocht stamcellen (AFSCs) gemakkelijk kunnen worden verkregen uit een kleine hoeveelheid tweede trimester AF, verzameld tijdens routine amniocentes , een procedure met spontane abortus percentage variërend van 0,06 tot 0,5% . Tot op heden zijn een aantal verschillende kweekprotocollen gerapporteerd, die leiden tot verrijkte stamcelpopulaties. De isolatie van AFSC en de respectieve kweekprotocollen werden samengevat in een recent overzicht door Klemmt et al. en kunnen als volgt worden gecategoriseerd: (i) een eenstaps kweekprotocol, waarbij de primaire kweek gedurende 7 dagen of langer ongemoeid werd gelaten totdat de eerste kolonies verschenen , (ii) een tweestaps kweekprotocol, waarbij amniocyten, die na 5 dagen in kweek nog niet gehecht waren, werden verzameld en verder geëxpandeerd , (iii) selectie van celoppervlaktemarker voor CD117 (c-kit receptor) , (iv) mechanische isolatie van de initiële mesenchymale progenitorcelkolonies gevormd in de initiële kweek , en (v) kortstondige kweek om fibroblastoïde kolonies te isoleren . De meerderheid van de AFSC’s, geïsoleerd volgens deze methodologieën, had een multipotent mesenchymaal fenotype en vertoonde een hoger proliferatiepotentieel en een breder differentiatiepotentieel in vergelijking met volwassen MSC’s. Amnionmembraan (AM)
Het amnionmembraan, dat geen vaatweefsel bevat, vormt het grootste deel van de binnenste laag van het foetale membraan en bestaat uit 3 lagen: (i) een epitheliale monolaag bestaande uit epitheelcellen, (ii) een acellulaire tussenliggende kelderlaag, en (iii) een buitenste mesenchymale cellaag, rijk aan mesenchymale stamcellen en geplaatst in de nabijheid van het chorion . AM werd gedurende vele decennia in de kliniek gebruikt voor wondgenezing bij brandwonden, bevordering van epitheelvorming en bescherming tegen infectie . Onlangs is het gebruik van AM geëvalueerd als wondverbandmateriaal voor chirurgische defecten van het mondslijmvlies , oculaire oppervlakte-reconstructie , hoornvliesperforaties , en blaasaugmentatie . Amniotische membraan stamcellen (AMSCs)
Amniotische membraan stamcellen (AMSCs) omvatten twee soorten, de amniotische epitheelcellen (AECs) en de amniotische membraan mesenchymale stamcellen (AM-MSCs) afgeleid van de amniotische epitheliale en de amniotische mesenchymale lagen, respectievelijk . Beide celtypes ontstaan tijdens de pregastrulatiefase van het zich ontwikkelende embryo, vóór de afbakening van de drie primaire kiemlagen, en zijn meestal van epitheliale aard. Er zijn verschillende protocollen vastgesteld voor de isolatie van AECs en AM-MSCs, voornamelijk gebaseerd op de mechanische scheiding van het AM van het chorionmembraan en de daaropvolgende enzymatische digestie. AM-MSCs vertoonden plastische adhesie en fibroblastoïde morfologie, terwijl AECs een kei epitheliaal fenotype vertoonden. AM-MSC’s vertoonden gelijkaardige fenotypische kenmerken als de AM-MSC’s afkomstig van volwassen bronnen. Interessanter is dat AM-MSC’s, net als AF-MSC’s, een hogere proliferatiesnelheid vertoonden in vergelijking met MSC’s afkomstig van volwassen bronnen en een multilineage differentiatiepotentieel in cellen afkomstig van de drie kiemlagen.
2. Immunofenotype
2.1. Amniotic Fluid Stem Cells
De AF is onlangs naar voren gekomen als een alternatieve foetale bron van een verscheidenheid van cellen van stamcel oorsprong . Hier willen we een overzicht geven van de belangrijkste merkers die AFSC’s karakteriseren. Tot op heden vertegenwoordigen MSCs de best gekarakteriseerde subpopulatie van AFSCs. De AF-MSCs vertoonden typische mesenchymale markerexpressie, zoals CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, en CD44, bepaald door flowcytometrie-analyses. Bovendien brachten deze cellen de HLA-ABC antigenen tot expressie, terwijl de expressie van de hematopoietische merkers CD34 en CD45, de endotheliale merker CD31, en het HLA-DR antigeen niet werd gedetecteerd. Belangrijker is dat de meerderheid van de gekweekte AF-MSCs pluripotentie markers tot expressie bracht zoals het octamer bindend eiwit 3/4 (Oct-3/4), de homebox transcriptiefactor Nanog (Nanog), en het stadium-specifiek embryonaal antigeen 4 (SSEA-4) .
Er werd ook gemeld dat amniocytenculturen een kleine populatie van CD117 (een tyrosinekinase specifiek voor stamcelfactor die voornamelijk aanwezig is in ESCs en primordiale kiemcellen) positieve cellen bevatten die klonaal kunnen worden uitgebreid in cultuur . De differentiatie-eigenschappen van CD117+ AFS werden voor het eerst in vivo getest, waardoor hun stamcelidentiteit werd bewezen. Experimenteel bewijs suggereerde dat AFSCs zijn afgeleid van spilvormige fibroblastoïde cellen.
In een poging om de AFSCs subpopulaties te analyseren, identificeerde onze groep onlangs twee morfologisch verschillende populaties van AFSCs van mesenchymale oorsprong, met verschillende proliferatie en differentiatie eigenschappen, aangeduid als spilvormig (SS) en rondvormig (RS) . Beide subpopulaties brachten mesenchymale stamcelmerkers in vergelijkbare mate tot expressie. Er werd echter vastgesteld dat SS-kolonies hogere niveaus van CD90 en CD44 antigenen tot expressie brachten in vergelijking met RS-kolonies. Amniotische membraan stamcellen (AMSCs)
Een gedetailleerde immunofenotype analyse van AMSCs onthulde de expressie van antigenen, zoals CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , stromale stamcelmerker 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, collageen I en III (Col1/Col3), alfa-gladde spieractine (α-SMA), CD44, vimentine (Vim), fibroblast oppervlakte-eiwit (FSP), en HLA-ABC-antigeen . Intercellulair adhesiemolecuul 1 (ICAM-1) kwam echter in zeer lage concentraties tot expressie en de eiwitten TRA-1-60, vasculair celadhesie-eiwit 1 (VCAM-1), von Willebrand factor (vWF), bloedplaatjes-endotheliaal celadhesiemolecuul (PECAM-1), CD3 en HLA-DR werden niet gedetecteerd. Een van de meest voorkomende eiwitten in AM-cellen is laminine, dat een sleutelrol speelt in differentiatie, celvorm en -migratie, en weefselregeneratie. RT-PCR-analyse toonde verder aan dat AMSC’s genen tot expressie brachten, zoals Oct-3/4, zinkvingereiwit 42 (zfp42 of Rex-1), stamcelfactor-eiwit (SCF), neurale celadhesiemolecule (NCAM), nestine (NES), botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP-4), GATA-bindend eiwit 4 (GATA-4), en hepatocyte-nucleaire factor 4α (HNF-4α), zelfs bij hoge passages. Brachyury, fibroblast groeifactor 5 (FGF5), gepaarde box protein (Pax-6), en bone morphogenetic protein 2 (BMP2) transcripts werden niet gedetecteerd. Evenzo waren AECs positief voor CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, en negatief voor CD14, CD34, CD45, CD49d, en HLA-DR expressies, zoals bepaald door FACS analyses. Verder onderzoek toonde aan dat AECs stamcelmerkers tot expressie brachten zoals SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, geslachtsbepalende regio Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 en Tra1-80, fibroblast groeifactor 4 (FGF4), Rex-1, cryptisch eiwit (CFC-1), en prominin 1 (PROM-1) .
3. Transcriptomics
3.1. Amniotic Fluid Stem Cells
Een functionele analyse van de genexpressiesignatuur van AF-MSC’s in vergelijking met beenmerg- (BM-), navelstrengbloed- (CB-), en AM-MSC’s werd aanvankelijk uitgevoerd door Tsai e.a. (Tsai e.a., 2002). Genen die tot expressie komen in MSCs van alle drie de bronnen konden worden ingedeeld in groepen die verband houden met (i) extracellulaire matrix remodellering (CD44, collageen II (COL2), insuline-achtige groeifactor 2 (IGF2), en weefselremmer van metalloproteïnase 1 (TIMP1)), (ii) cytoskeletregulatie (urokinase-type plasminogeen activator (PLAU) en -receptor (PLAUR)), (iii) chemokineregulatie en adhesie (alpha actinine 1 (ACTN1), actine-gerelateerd eiwitcomplexsubeenheid 1B (ARPC1B) en trombospondine 1 (THBS1)), (iv) plasmine-activering (tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2)), (v) transformerende groeifactor β (TGFβ) receptor signalering (caveolin 1 (Cav1), caveolin 2 (Cav2), cycline-afhankelijke kinase inhibitor 1A (CDKN1A)), en (vi) genen die coderen voor E3 ubiquitine ligasen (SMURF). Tot de geüpreguleerde genen in AF-MSCs in vergelijking met BM-, CB- en AM-MSCs behoorden moleculen die betrokken zijn bij de rijping en samentrekking van de baarmoeder, zoals de oxytocinereceptor (OXTR) en de regulering van de prostaglandinesynthese, zoals fosfolipase A2 (PLA2G10). Andere geüpreguleerde genen in deze groep waren betrokken bij signaaltransductie met betrekking tot (i) trombine-geactiveerde respons ((F2R en F2RL)), (ii) hedgehog-signalering ((hedgehog acyltransferase (HHAT)), en (iii) G-eiwit-gerelateerde pathways (rho-gerelateerd GTP-bindend eiwit (RHOF), regulator van G-eiwit signalering 5 en 7 (RGS5, RGS7), en fosfolipase C beta 4 (PLCB4)).
In recente studies over AFSCs, beschreven Kim et al. voor de eerste keer de genexpressieveranderingen in de totale AFSC-populatie tijdens verschillende passages door illumina microarray-analyse. 1970 differentieel tot expressie komende genen werden gedetecteerd en gecategoriseerd op basis van hun expressieprofielen in 9 verschillende clusters . Genen met geleidelijk stijgende expressieniveaus waren onder meer chemokine (C-X-C motief) ligand 12 (CXCL12), cadherine 6 (CDH6), en folaatreceptor 3 (FOLR3). Gedownreguleerde genen waren onder meer cycline D2 (CCND2), keratine 8 (K8), IGF2, natriuretische peptide precursor (BNP) B, en cellulair retinoïnezuur bindend eiwit 2 (CRABPII) . Om meer informatie te verkrijgen, werd chip data analyse op verouderingsgenen uitgevoerd en onthulde upregulatie van gen transcripten, zoals zenuwgroeifactor beta (NGFβ), insuline receptor substraat 2 (IRS-2), insuline-achtige groeifactor bindend eiwit 3 (IGFBP-3), en apolipoproteïne E (APOE). Expressie van genen, zoals PLAU, E2F transcriptiefactor 1 (E2F1), IGF2, borstkanker type 1 vatbaarheidsgen (BRCA1), DNA topoisomerase 2-alfa (TOP2A), prolifererend cel nucleair antigeen (PCNA), forkhead box M1 (FOXM1), cycline-A2-gen (CCNA2), budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (BUB1B), en cycline dependent kinase 1 (CDC2), werd geleidelijk gedegradeerd tijdens de kweek.
Wolfrum et al. voerden een globale genexpressieanalyse uit van AFSC’s in vergelijking met iPSC’s afgeleid van AF (AFiPSC) en ESC’s . Daaronder genen gerelateerd aan zelfvernieuwing en pluripotentie (1299 genen, bijv. POU klasse 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, microRNA-bindend eiwit LIN28) en AFSCspecificiteit (665 genen, bijv, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatose type 2 (NF2), protectine (CD59), tumor necrose factor superfamilielid 10 (TNFSF10), 5′-nucleotidase (NT5E)) werden gedetecteerd in AFSCs . Bovendien onderzochten de auteurs de expressie van senescentie en telomeer geassocieerde genen in AFSCs van vroege en latere passage, om het effect van herprogrammering op het omzeilen van senescentie waargenomen in AFSC culturen te bestuderen. Vierenzestig genen werden geïdentificeerd als differentieel tot expressie gebracht in AFSCs in vergelijking met AFiPSC lijnen. Van deze, telomeer-geassocieerde genen en genen die betrokken zijn bij de regulering van de celcyclus, zoals de mitotische arrestatie deficient-like 2 (MAD2L2), de poly ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), replicatie eiwit A3 (RPA3), de dyskeratosis congenita 1 (DKC1), de mutS homolog 6 (MSH6), de CHK1 checkpoint homolog (CHEK1), de polo-like kinase 1 (PLK1), de POU klasse 2 homeobox 1 (POU2F1), de CDC2, het Bloom syndroom gen RecQ helicase-like (BLM), het Werner syndroom RecQ helicase-like (WRN), de DNA methyltransferase 1 (DNMT1), de DNA methyltransferase 3 beta (DNMT3B), de lamin B1 (LMNB1), en de DNA replicatie factor 1 (CDT1), werden gedownreguleerd in AFSCs in vergelijking met AFiPSCs en ESCs. Daarentegen werden peptidylprolyl cis/trans isomerase (PIN1), lamin A/C (LMNA), growth arrest and DNA damage inducible alpha (GADD45A), chromobox homolog 6 (CBX6), NADPH oxidase 4 (NOX4), endoglin (ENG), histon H2B type 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A groeidifferentiatiefactor 15 (GDF15), en serineproteaseremmer 1 (SERPINE1), onder andere, waren hoger in AFSC’s in vergelijking met AFiPSC’s en ESC’s.
3.2. Amniotic Membrane Stem Cells
Transcriptomische analyse met behulp van DNA-microarrays is gerapporteerd voor AM-MSCs . Deze experimentele gegevens verschaften informatie over het AM-MSC genexpressiepatroon vergeleken met genexpressieprofielen van AF, CB, en BM-MSCs. Verschillende geüpreguleerde genen in AM-MSCs die betrokken zijn bij de regulatie van de immuunadaptatie tussen de maternoplacentale interface werden geïdentificeerd. Onder andere spondine 2 (SPON2), interferon, alpha induceerbaar eiwit 27 (IFI27), bradykinine receptor B1 (BDKRB1), kleine induceerbare cytokine subfamilie B lid 5 en 6 (SCYB5, SCYB6), en Yamaguchi sarcoma viral-related oncogene homolog (LYN) bleken geüpreguleerd te zijn. Bovendien omvatten andere genen met verhoogde expressie in AM-MSCs in vergelijking met AF, CB, en BM-MSCs (i) transcriptiefactoren, zoals forkhead box F1 (FOXF1), heart and neural crest derivatives expressed 2 (HAND2), en transcriptiefactor 21 (TCF21) en (ii) metabolische enzymen, zoals dipeptidyl-peptidase 6 (DPP6), tryptofaan 2,3-dioxygenase (TDO2), en sialyltransferases (STs) .
4. Proteomics
4.1. Amniotic Fluid Stem Cells
Proteomische studies op de totale AFSC populatie, inclusief epithelioide (E-type), amniotic fluid specifieke (AF-type), en fibroblastic (F-type) cellen, onthulden 2400 spots die resulteerden in de identificatie van 432 verschillende genproducten. Het merendeel van de eiwitten was gelokaliseerd in het cytoplasma (33%), de mitochondriën (16%) en de celkern (15%) en vertegenwoordigde hoofdzakelijk enzymen (174 eiwitten) en structurele eiwitten (75 eiwitten). Een relatief hoog percentage membraan- en membraangeassocieerde eiwitten was ook aanwezig (7%) . Van de ontdekte eiwitten kwamen er 9 overeen met epitheelcellen, zoals ATP synthase D keten (ATP5H), NADH-ubiquinone oxidoreductase 30 kDa subunit (NUIM), annexine II (Anx2), annexine IV (Anx4), 40S ribosomaal eiwit SA (Rpsa), glutathion S-transferase P (GSTP), major vault protein, en cytokeratines 19 en 7 (CK-19, CK-7), terwijl 12 eiwitten tot expressie zouden komen in fibroblasten, waaronder fibronectines, tropomyosines, transgeline (TAGLN), arp2/3 complex 34 kDa subunit (P34-arp), gelsolin (Gsn), elongatiefactor 1-β (EF-1β), en andere. Acht eiwitten bleken tot expressie te komen in keratinocyten, waaronder keratinen, ribonucleoproteïnen, Anx2, aetyl-CoA acetyl-transferase (ACAT1) en andere, drie in de opperhuid, waaronder tropomyosinen en keratinen, en één in mesenchymale cellen (vimentine 1 (Vim 1)).
Recente studies leverden het bewijs dat een diversiteit van metabole enzymexpressie in de amnioncellen betrokken is bij metabole en genetische syndromen, en dus zou hun detectie belangrijk kunnen zijn voor prenatale diagnose. Een meer gedetailleerde analyse voor het bepalen van specifieke metabole enzymen aanwezig in AFSCs werd gerapporteerd door Oh et al. Negenennegentig eiwitten werden geïdentificeerd, zoals koolhydraatbehandelende enzymen, aminozuurbehandelende enzymen, eiwitten van purinemetabolisme, en enzymen van intermediair metabolisme.
Een proteomische analyse werd ook uitgevoerd op verschillende kweekgangen van CD117+ AFSC’s, waarbij variaties in eiwitexpressie werden aangetroffen die voornamelijk in vroege lagen voorkwamen. Drieëntwintig eiwitten kwamen verschillend tot expressie tussen vroege en late passages, waarbij de eiwitten die het meest gedownreguleerd werden, Col1, Col2, vinculin (Vcl), CRABP II, stathmin (STMN1) en cofilin-1 (CFL1), het meest bleven hangen. Daarentegen zijn TAGLN en Col3 verhoogd tijdens de passages. Eiwitten die ontregelde niveaus vertoonden tijdens de passages waren de 26S protease regulerende subeenheid 7 (PSMD7), het ubiquitine carboxyl terminal hydrolase isoenzym L1 (UCH-L1), het heterogene nucleaire ribonucleaire eiwit H (hnRNP H), en het TAR DNA-bindende eiwit 43 (TDP-43) .
In 2007 werd de proteomische kaart van menselijke AF-MSCs geconstrueerd en direct vergeleken met die van BM-MSCs . 261 verschillende eiwitten werden geïdentificeerd in AF-MSCs met de meerderheid van de eiwitten gelokaliseerd in het cytoplasma (41%), terwijl andere werden gevonden in het endoplasmatisch reticulum (8%), kern (13%), mitochondriën (12%), ribosomen (1%), cytoskelet (6%), cytoplasma en de kern (5%), en gesecreteerde (2%) eiwitten . AF-MSC’s brachten een aantal eiwitten tot expressie die verband houden met proliferatie en celbehoud, zoals ubiquilin-1 (UBQLN1), waarvan bekend is dat het de celcyclusprogressie en celgroei controleert, het proliferation associated protein 2G4 (PA2G4), een nucleolair groeiregulerend eiwit, het secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC), dat tijdens de embryogenese wordt gereguleerd en betrokken is bij de controle van de celcyclus en de celadhesie, en de enhancer of rudimentary homolog (ERH), die ook de celcyclus regelt. TAGLN en galectine 1 (Gal 1), die beide aanwezig zijn in stamcellen en gerelateerd zijn aan differentiatie, kwamen ook overvloedig tot expressie in AF-MSCs. Andere eiwitten die in hoge mate tot expressie kwamen in AF-MSCs waren gerelateerd aan (i) ontwikkeling, zoals Deltex-3-like (DTX3L), en (ii) cytoskeletale organisatie en beweging, zoals CFL1, het coactosine-achtig eiwit (CLP), en het geactiveerde eiwit homoloog (Enah). Zoals verwacht werd Vim ook in hoge hoeveelheden uitgedrukt in AF-MSCs. In deze studie werd ook een gedetailleerde vergelijking van de gemeenschappelijke geïdentificeerde eiwitten in AF-cellen en AF-MSC’s beschreven.
In onze latere studie hebben we de proteomische kaart van de twee morfologisch verschillende AF mesenchymale progenitor celtypen (SS en RS) door 2-DE vastgesteld. Vijfentwintig eiwitten kwamen differentieel tot expressie in de twee subpopulaties. Eiwitten die meer tot expressie kwamen in SS-AF-MSC’s in vergelijking met RS-AF-MSC’s waren onder meer reticulocalbine-3 precursor (RCN3), collageen α1 (I) (COL1α1), FK506-bindend eiwit 9 precursor (FKBP9), Rho GDP-dissociatie inhibitor 1 (RhoGDI), chloride intracellulair kanaal eiwit 4 (CLIC4), tryptofanyl-tRNA synthetase (TrpRS), en 70 kD heat shock proteïne (HSP70). Peroxiredoxine 2 (Prdx2), 60 kD heat shock protein (HSP60), GSTP, en Anx4 werden in RS-AFMPCs verhoogd. Proteïnen die echter alleen in RS-AF-MSC’s werden geïdentificeerd waren cytokeratine-8, -18 en -19 (CK-8, -18 en CK-19), cathepsine B (CTSB), CLP en integrine αV proteïne (CD51). Mesenchymaal-gerelateerde proteïnen, zoals Vim, Gal, Gsn, en prohibitin (PHB), kwamen in beide populaties op dezelfde niveaus tot expressie. Amniotic Membrane Stem Cells
Een gedetailleerde benadering voor het bestuderen van menselijke AM-eiwitten werd beschreven door Hopkinson et al. In deze studie voerden de auteurs een proteomische analyse uit van AM-monsters die waren geprepareerd voor menselijke transplantatie, door gebruik te maken van 2-DE-gels. De wasmedia van de AM stalen werden ook onderzocht en de gesecreteerde eiwitten werden geïdentificeerd. Eiwitten die zowel in het AM als in de wasvloeistoffen werden gedetecteerd, suggereerden dat gedeeltelijk eiwitten waren vrijgemaakt. Deze eiwitten waren meestal oplosbare cytoplasmatische eiwitten en werden gecategoriseerd op basis van hun subcellulaire lokalisatie en functie. Een voorbeeld van de meest overvloedige en consistente eiwitten in AM is THBS1, dat naar verluidt een rol speelt bij wondreparatie, ontstekingsreactie en angiogenese. Mimecan (ook osteoglycine/OGN genoemd) is een ander eiwit dat in AM werd aangetroffen en dat een klein leucinerijk proteoglycaan vertegenwoordigt dat in de ECM van bindweefsel wordt aangetroffen. Mimecan zou de treksterkte en de hydratatie van het weefsel in stand houden. Bovendien werd de grotere vorm van mimecan tot expressie gebracht in AM-cellen en was het gevoelig voor proteolytische splitsing. TGF-β-geïnduceerd proteïne ig-h3 (βIG-H3), een ECM-adhesieve molecule die als een membraan-geassocieerde groeifactor tijdens celdifferentiatie en wondgenezing optreedt, en intergrine α6 (CD49f), een component van α6β4 integrine, waren ook in significante hoeveelheden aanwezig in AM-cellen . Het is bekend dat de α6β4-βIG-H3 interactie een belangrijke rol speelt in het mediëren van celadhesie en wondherstel signaalwegen.
Een andere belangrijke studie van Baharvand et al. was gericht op de analyse van epithelium-gededuceerd menselijk AM en toonde zowel kwantitatieve als kwalitatieve verschillen aan in vergelijking met onbehandeld AM. Zij onderzochten het proteoom van het humane AM epitheel, dat gebruikt werd als een limbal stamcel niche voor de behandeling van oculaire oppervlakte reconstructie . 515 spots werden gedetecteerd in alle 2-DE gels en 43 eiwitten werden geïdentificeerd met behulp van MALDI TOF/TOF MS in AM. De meest overvloedige eiwitten waren verschillende isovormen van lumican (LUM) en OGN, beide leden van de proteoglycan (PG) familie. In het bijzonder zou OGN een rol kunnen spelen in vele biologische processen, waaronder celgroei, angiogenese en ontsteking. Andere ontdekte eiwitten zijn collageen VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), fibrinogeen beta keten (FGB), transglutaminase 2 isovorm A (TGM2A), b-actine variant (ACTB), 70 kD heat shock protein 5 (HSPA5), nidogen 2 (NID2), CD49f, βIG-H3, en tubulointerstitiële nefritis (TIN) . Sommige van de in deze studie geïdentificeerde eiwitten waren ook gerelateerd aan de extracellulaire matrix (ECM). Onder de gedetecteerde, werden fibronectine (FN), laminines, en collageen IV (Col4) en VII gerapporteerd om epitheliale adhesie en migratie te bevorderen. Secretome
Recentelijk is aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot de analyse van de gesecreteerde eiwitten van AFSCs. Het is gedocumenteerd dat AFSC secretoom verantwoordelijk was voor het versterken van vasculogenese en in staat was om een sterke angiogene respons op te roepen in muriene ontvangers. Volgens deze studie onthulde een gedetailleerde analyse van de AFSC-geconditioneerde media de aanwezigheid van bekende proangiogene en antiangiogene factoren met behulp van de MAP-technologie van Luminex. Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), van stromale cellen afgeleide factor 1 (SDF-1), interleukine 8 (IL-8), monocyt chemotactisch proteïne 1 (MCP-1), en twee angiogeneseremmers, interferon-gamma (IFNγ) en interferon gamma-geïnduceerd proteïne 10 (IP-10), werden geïdentificeerd als afgescheiden eiwitten. Er werd ook aangetoond dat een relatief klein aantal AFSC voldoende was om een detecteerbare hoeveelheid proangiogene groeifactoren en cytokines uit te scheiden. De secretie van deze kan worden geregeld in een dosis-afhankelijke wijze, afhankelijk van het oorspronkelijke aantal van de gebruikte cellen.
Een systematische studie van AFSC-gescheiden eiwitten leidde tot de conclusie dat proangiogene oplosbare factoren van AFSCs kunnen mediëren de rekrutering van endotheliale progenitors in een ischemische rat model . In het bijzonder kon geconditioneerd medium afkomstig van AFSCs plaatselijk angiogene groeifactoren en cytokines afgeven in de huidflap van het ischemische ratmodel en was verantwoordelijk voor het op gang brengen van het endogene herstel door het rekruteren van endotheliale progenitorcellen.
In onze recente studies onderzochten we het therapeutische potentieel van AF-MSCs en hun afgescheiden moleculen bij muizen met acuut leverfalen. Een verscheidenheid van cytokines en groeifactoren werden gedetecteerd in AF-MSC geconditioneerd medium. Cytokines zoals interleukine 10 (IL-10), interleukine 27 (IL-27), interleukine 17 familie (IL-17E), interleukine 12p70 (IL-12p70), interleukine-1 beta (IL-1β), en interleukine-1 receptor antagonist (IL-1ra), die verantwoordelijk zijn voor het induceren van lokale en systemische downregulatie van pro-inflammatoire mediatoren, werden gedetecteerd. SERPINE1, MCP-1, en SDF-1, verantwoordelijk voor het bevorderen van weefselherstel, werden ook uitgescheiden. Interessant is dat onder de sterk tot expressie gebrachte groeifactoren de van bloedplaatjes afgeleide endotheelcel-groeifactor (PD-ECGF), endostatine/collageen XVII (EN/Col17), urinaire plasminogeen activator (uPA), TIMP1, TIMP2, heparine-bindende EGF-achtige groeifactor (HB-EGF), fibroblast groeifactor 7 (FGF7), en epidermale groeifactor (EGF), verantwoordelijk voor leverregeneratie en weefselherstel, waren.
6. Samenvatting
De huidige gegevens tot nu toe suggereren dat vruchtwater en vruchtwatermembraan veelbelovende bronnen kunnen zijn voor stamcellen van mesenchymale oorsprong. MSCs zijn inderdaad overvloediger aanwezig en er is een breed scala aan protocollen beschreven voor hun isolatie. Er is echter gerapporteerd dat verschillende kweekomstandigheden van hetzelfde type cellen van invloed kunnen zijn op hun differentiële genexpressiepatroon, hetgeen een beperking vormt voor hun isolatie en expansie in vitro. Studies met fenotypische analyse, waarbij gebruik wordt gemaakt van methodologieën zoals flowcytometrie en immunohistochemie, alsmede benaderingen op het gebied van transcriptomica, proteomica en secretoomanalyse, zijn erop gericht het eiwitprofiel van deze cellen te bepalen (figuur 1). Verwacht wordt dat de gegevens uit dergelijke studies hun differentieel repertoire zullen verduidelijken en het moleculaire profiel van deze stamcellen zullen valideren. De belangrijkste kwestie die echter dringend moet worden aangepakt, is de isolatie van een homogene populatie die systematische studies voor de opheldering van de functie van deze multipotente cellen kan vergemakkelijken.
Samenvatting van de belangrijkste markers die in AFC’s en AMC’s zijn geïdentificeerd door het gebruik van transcriptomics, proteomics, secretome, en immunofenotypische analyses. Eiwitten die in meer dan één studie zijn geïdentificeerd, zijn vetgedrukt.
Dergelijke benaderingen kunnen leiden tot de identificatie van belangrijke antigenen die het fenotype van deze cellen weerspiegelen en hun onderscheidende eigenschappen verklaren. Dit soort studies zal de weg openen voor een systematische en efficiënte isolatie van deze cellen vóór hun gebruik in de klinische setting.
Appendix
Vragen voor verder onderzoek
Wat zijn de geschikte isolatiemethoden en kweekomstandigheden van AFSC’s of AMSC’s die de identificatie van een consistent fenotype mogelijk zullen maken?
Is er één enkele marker die voor de isolatie van AFSC’s of AMSC’s kan worden gebruikt?
De AFSC- en AMSC-populaties zijn heterogeen en verschillen in hun fenotypische en moleculaire eigenschappen. Methoden van isolatie kan resulteren in een homogene celpopulatie.
AFSCs of AMSCs kunnen worden gebruikt als instrumenten in de regeneratieve geneeskunde: oprichting van kweekomstandigheden met minimale of geen dierlijke stoffen.
Marker Discovery
De AFSCs en de AMSCs initiële karakterisering kan worden uitgevoerd door immunofenotype analyse met behulp van goed gekarakteriseerde celoppervlak markers, zoals AFSCs: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSCs: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1, en PROM1.
Transcriptomics and Proteomics Revealed the Identification of Key Markers Expressed such as
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1, en Gal; AMSCs: OGN, βIG-H3, en CD49F.
Aangezien er geen gemeenschappelijke merker voor AFSC en AMSC beschikbaar is, moet een breder panel van merkers worden gebruikt. Dit dringt ook aan op de uitvoering van verdere gedetailleerde array- en functionele analyses om de meest geschikte markers voor AFSC- en AMSC-karakterisering te definiëren.
Conflict of Interests
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.