De condensor – verschillende typen. Contrast in de microscoop
In het vorige artikel over het oculair heb ik erop gewezen dat het oculair normaal gesproken zo is geplaatst dat het voorste brandvlak samenvalt met het primaire beeldvlak (PIP). Het PIP is conjugaat met het preparaat in de reeks van conjugaatvlakken, en is dus nuttig voor het meten van kenmerken van microscopische preparaten.
Op dezelfde manier is het voorste brandvlak van de condensor conjugaat met het achterste brandvlak van het objectief (maar niet met het preparaat) in de belichtingsreeks van stralen. De condensor is dus een toegankelijke plaats waar we het contrast van het beeld kunnen veranderen of regelen door de lichtstralen te manipuleren. Deze twee principes vloeien voort uit Köhlers methode van belichten, die in deel 3 van deze serie is behandeld.
De functie van de condensor
De condensor vervult twee functies in de microscoop. Hij zorgt voor een gebied van gelijkmatig verlicht licht in het gezichtsveld op het preparaatvlak en verlicht het diafragma van het objectief gelijkmatig met licht van voldoende doch controleerbare hoek. Ten tweede, zoals hierboven vermeld, verschaft het een middel om het contrast te regelen (Bradbury & Evennett, 1996). De eenvoudigste vorm van condensor is de concave spiegel, maar deze is niet bruikbaar voor objectieven boven NA 0.2 of zo. Als uw microscoop is uitgerust met een spiegel en een lichtbron op afstand, moet de vlakke kant van de spiegel worden gebruikt in combinatie met een eventueel aangebrachte subfase condensor. Dit komt omdat, strikt genomen, de condensor een parallelle verlichting moet ontvangen en dus dit licht tot een brandpunt moet brengen in het achterste brandvlak van de condensor (waar het preparaat zich bevindt).
Typen condensor
Het meest gebruikte type condensor is de Abbe-condensor voor helderveldmicroscopie (figuur 1a, 1b). Hij bestaat uit twee of drie lenzen, en de bovenste korte-focus lens kan gewoonlijk uit het optische pad worden geklapt (1a), of losgeschroefd (1b), om het gezichtsveld te vullen met laag-vermogen objectieven. Dit eenvoudige belichtingstoestel is voldoende voor de meeste soorten microscopie. Het is oorspronkelijk ontworpen om smalle bundels (of “potloden”) van schuin licht te leveren vanuit een excentrisch geplaatste opening in het voorste brandvlak van de condensor. Figuur 1c toont een eenvoudig Abbe-belichtingstoestel met twee lenzen, gemonteerd op een subaggregaat dat excentrisch kon worden gedraaid en bewogen om schuine verlichting te verkrijgen. Figuur 1d toont een condensor met een laag vermogen, ontworpen om het grote gezichtsveld van objectieven met een zeer lage vergroting volledig te vullen.
Hoewel een numerieke apertuur voor de condensor kan worden vermeld (vaak 0,9 NA voor droge condensors en maximaal 1,4 NA voor olie-immersietypes), geven deze cijfers geen indicatie van de NA waarvoor de verlichtingsstralen voor sferische aberratie zijn gecorrigeerd. In veel eenvoudige condensors wordt een vaste lichtkegel voor axiale belichting zelden gecorrigeerd voor sferische aberratie boven 0.45 NA. Voor werk van hoge kwaliteit, en voor het oplossen van structuur op de grens van resolutie, moeten condensors gecorrigeerd zijn voor aberraties. Volledig gecorrigeerde condensors bevatten, net als objectieven, veel lenselementen en kunnen bijna in dezelfde mate worden gecorrigeerd. De achromatisch-aplanatische condensor (1e) is gecorrigeerd voor zowel sferische als chromatische aberratie, en moet worden gebruikt voor het werk van de hoogste kwaliteit, en voor kleurenfotomicrografie. Aplanatische condensors worden alleen gecorrigeerd voor sferische aberratie.
Zogenaamde “universele” condensors (figuur 2) zijn multifunctioneel. Zij bestaan uit een ronddraaiende schijf waarop een selectie van openingsdiafragma’s, filters, patch stops, faseplaten of Wollaston prisma’s voor differentiële interferentie contrast (DIC). Door deze opstelling kan gemakkelijk van de ene contrastmethode naar de andere worden overgeschakeld. De donkere-grond patchstop werkt in het algemeen slechts tot NA 0,5 of daaromtrent. Voor gebruik met objectieven met een hogere NA moet een speciaal geconstrueerde donkergrondcondensor (figuur 3) worden gebruikt. Voor details over het gebruik hiervan en andere contrastverhogende methoden, zie Bradbury & Evennett (1996).
Figuur 2. Universele condensatoren. In het middelste beeld is de bovenkap verwijderd, waardoor de ronddraaiende schijf zichtbaar wordt waarin zich de diafragma-annuli, de DIC-prisma’s, de donkergrondstop, de Rheinberg-schijven en de Hoffman-modulatiefilters bevinden. De meeste universele condensors bezitten een diafragma-iris voor helderveldwerk, verscheidene annuli voor fasecontrast en een donkergrondstop voor donkergrondwerk met laag vermogen.
Figuur 3. Donkergrondcondensatoren. 3(a) Droge donkergrondcondensor. 3(b) & 3(c) Donkergrondcondensors met olie-immersie. 3(d) Verstelbare olie-immersie donker-grond condensor; deze condensor kan worden aangepast aan verschillende diktes van de lantaarnplaten, om een hoge kwaliteit donker-grond beeld te geven.
Microscopie met doorvallend en gereflecteerd licht
De opstelling van de doorvallend-lichtmicroscoop vereist een aparte condensor, omdat het licht eerst op het preparaat wordt gecondenseerd (waarbij het licht in wisselwerking treedt met materie), en vervolgens door het objectief verder langs de optische as wordt opgevangen.
De situatie in de gereflecteerd-lichtmicroscoop is anders. Hier is de weg van de lichtstraal gevouwen om de as van het preparaat waar het licht wordt weerkaatst door het oppervlak. Het objectief fungeert als zijn eigen condensor, en de uitlijning van de gereflecteerde-lichtmicroscoop is zeer sterk vereenvoudigd (zie de ray diagrams in deel 2 van deze serie). Het achterste brandvlak van het objectief (voorste brandvlak bij gebruik als condensor) is echter moeilijk bereikbaar, dus worden extra lenzen gebruikt om een positie te creëren waarbij het beeld van diafragma’s en filters conjugaat is met het achterste brandvlak.
Het incident-lichtsysteem is zeer nuttig voor fluorescentiemicroscopie, vooral omdat de belichting van het preparaat eenvoudig is, het efficiënter is (het geeft helderdere beelden bij hoge vergrotingen) en de combinatie met andere contrastmethoden door middel van doorvallend licht is toegestaan.
Figuur 4. Illustratie van een epi-illuminator voor microscopie met gereflecteerd licht
In deze epi-condensator zijn twee soorten objectieven voor gereflecteerd licht in het neusstuk aangebracht. Het gebruikte objectief is ontworpen voor donkere-grond belichting, terwijl de andere twee objectieven die kunnen worden gezien voor helder veld gereflecteerd-licht werk. De brede kragen rond deze laatste twee objectieven zorgen ervoor dat het objectief op de optische as kan worden gecentreerd. De “D” op de behuizing van de epi-illuminator duidt op het verwisselbare inzetstuk waarmee het apparaat kan worden gebruikt voor donkerveldverlichting. Deze kan worden vervangen door een vlakke spiegel voor helderveldmicroscopie met gereflecteerd licht. De doorvallend-licht condensor is van onder de tafel verwijderd.
Als het objectief als zijn eigen condensor fungeert bij reflectie microscopie, waarom worden objectieven dan niet ook gebruikt voor verlichting bij doorvallend-licht microscopie? Afgezien van de praktische moeilijkheid om toegang te krijgen tot het achterste brandvlak van het objectief, is het moeilijk om objectieven multifunctioneel te gebruiken en is de belichtingshoek gewoonlijk niet regelbaar (door een irisdiafragma in het achterste brandvlak van het objectief).
Basisprincipes van contrastverbetering
Voor ons is voldoende zichtbaarheid, of contrast, nodig om de details in het beeld waar te nemen die door onze microscopen worden opgelost. Selectiviteit is belangrijk: wij hebben ten minste enige regionale verschillen binnen het object, en tussen het object en de achtergrond, nodig om details te kunnen onderscheiden.
Contrast in het beeld wordt op drie manieren verkregen, afzonderlijk of in combinatie. Dit zijn:
- interactie tussen object en licht,
- manipulatie van de belichting, en
- manipulatie van het beeldopnamemedium.
Verandering van contrast in deel c) kan worden bereikt door fotografische ontwikkeling en/of afdrukken, en ook door gebruik te maken van elektronisch contrast van analoge video of digitale beelden. In de delen a) en b) is de condensor echter van essentieel belang voor het manipuleren van contrast en zichtbaarheid in het beeld. Nadere bijzonderheden over de theoretische en praktische aspecten van contrasttechnieken in de lichtmicroscopie zijn te vinden in Bradbury & Evennett, 1996 en Sanderson, 2002, 2000, 1998 en 1994. Kort samengevat zijn de bekendste vormen van contrastvorming helderveld, schuine belichting, donkere-grond & Rheinberg, fasecontrast en DIC. Het is ook mogelijk deze methoden te combineren met verschillende vormen van belichting (b.v. gepolariseerd licht met Rheinberg, of fasecontrast door doorvallend helderveld met invallende fluorescentie). Aangezien contrastverbetering sterk onder de controle van de microscopist valt, kan het belang van het juiste gebruik van de condensor niet genoeg worden benadrukt.
De condensor moet goed worden scherpgesteld (zie deel 3, het instellen van de microscoop voor Köhler verlichting) om de beste kwaliteit beeld te verkrijgen. Dit geldt ongeacht de methode van contrastverbetering (helderveld, fase, donkere achtergrond) die wordt gebruikt. Het meest voor de hand liggende effect van een onscherp afgestelde condensor bij helderveldmicroscopie is een aanzienlijk verlies van oplossend vermogen, hetgeen op zijn beurt leidt tot een “rot” beeld met diffractiehalo’s rond elk punt in het beeld. Hetzelfde resultaat treedt op als de bovenste (korte-focus) lens wordt weggelaten of weggelaten wanneer een hoog vermogen objectief wordt gebruikt, en het achterste brandvlak van het objectief niet volledig met licht wordt gevuld.
Wanneer fasecontrast microscopie wordt geprobeerd met een verkeerd gefocusseerde condensor, zal de annulus in de condensor vaak niet overeenkomen met de diameter van de fase ring in het achterste brandvlak van het objectief, en gaat elke contrast verbetering verloren. Problemen met het scherpstellen van de condensor kunnen ook resulteren in slechte donkere-grond microscopie, als het beeld van de patch stop niet volledig de directe verlichting van het objectief afsluit. Het volgende deel in deze serie gaat terug naar het objectief, en behandelt de buislengte, en hoe de brandpuntsafstand, vergroting, diafragma en andere parameters van uw objectieven te bepalen.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrastverbeteringstechnieken voor lichtmicroscopie in celbiologie: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (ed). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (4-vol set) 0-12-164725-0; vol 3 only = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.