The Discovery of Water Channels (Aquaporins)

Abstract

A víz mozgása a sejtekbe és a sejtekből kifelé alapvető biológiai folyamat, amely elengedhetetlen az élethez. Ez a vízmozgás nemcsak az egyes sejtek aktivitását szabályozza, hanem számos szervrendszer működéséért és az egész test vízháztartásának fenntartásáért is felelős. Régóta gyanították, hogy a biológiai sejtmembránokon keresztüli vízmozgást valamilyen módon pórusok vagy csatornák segítik elő, de e csatornák azonosítása hosszú és fáradságos volt. Ahogy a tudományban gyakran előfordul, a vízcsatorna titkát végül 1992-ben véletlenül fedezte fel Peter Agre és munkatársai a baltimore-i Johns Hopkins Egyetemen, akik a vörösvérsejtek membránfehérjéin dolgoztak. Ezt az “első” vízcsatornát eredetileg CHIP28-nak nevezték el, ma pedig aquaporin 1 néven ismert. 2003-ban Agre ezért a felfedezésért kémiai Nobel-díjat kapott. Jelenleg 13 ismert aquaporin van az emlősökben, amelyek a legtöbb szövetben eloszlanak, de sokkal többet azonosítottak alacsonyabb rendű szervezetekben és a növényvilágban. Az aquaporinok részvétele olyan folyamatokban, mint a vizeletkoncentráció és a testfolyadék homeosztázis, az agyműködés, a mirigyek kiválasztása, a bőr hidratálása, a férfi termékenység, a hallás, a látás és a legtöbb elképzelhető fontos testfunkció, ma már mind intenzív tudományos vizsgálat tárgyát képezik. Sőt, az aquaporinok működésének hibáit különböző betegségekkel és kóros állapotokkal hozták összefüggésbe. Ez a rövid áttekintés a hátterüket, felfedezésüket és funkciójukat tárgyalja a kiválasztott testi folyamatokban, különös tekintettel a hidratációra.

© 2017 The Author(s) Published by S. Karger AG, Basel

Miért érdekelnek minket a vízcsatornák?

A testünket alkotó sejtek nagyrészt vízből állnak. Egy sejt körülbelül 65%-a víz. A teljes testtömeget tekintve a csecsemők a leg “lédúsabbak”, mivel 75%-ban vízből állnak; a sovány felnőttek 60%-ban, míg az idősebbek csak 50%-ban tartalmaznak vizet. A test nem vizes, száraz tömegének nagy részét a csontok teszik ki. Összehasonlításképpen, talán a legvízteljesebb szervezet a fejes saláta (95% víz), míg mi, emberek egy banánhoz hasonlítunk (65% víz). Az evolúció során minden élőlény sejtjei úgy alakultak ki, hogy ilyen vizes környezetben működjenek optimálisan, és a sejtek víztartalmának jelentős eltérései koncentrálják vagy hígítják molekuláris összetevőiket, és megakadályozzák a normális működést. Ezért a sejteknek szabályozniuk kell a plazmamembránjukon keresztül be- és kilépő víz mennyiségét, hogy szabályozni tudják az oldott anyagok, ionok, elektrolitok, fehérjék és nukleinsavak citoszolikus koncentrációját. Ezenkívül a szervezeten belüli extracelluláris terekben lévő víz mennyisége is szigorúan szabályozott. Az embernél és más emlősöknél ez magában foglalja, de nem kizárólagosan a vér térfogatát, a vérereken kívüli intersticiális teret, az agy-gerincvelői folyadékot, a szem vizes nedvét és a mirigyek váladékát.

Miért van szükségünk vízcsatornákra?

A folyamatosan változó metabolikus igények és környezeti feltételek miatt a sejteknek gyorsan kell vizet cserélniük a citoplazmájuk (belül) és a külső környezet (kívül) között az állandó térfogat fenntartása érdekében. Ez sok alacsonyabb rendű organizmus számára fontos, amelyek kidolgozott mechanizmusokat fejlesztettek ki a sejtek térfogatszabályozására, és általában nemcsak a víztranszportot, hanem a membránokon keresztüli ionáramlást (főként Na+, K+ és Cl-) is magában foglalja, hogy helyreállítsák a túlzott duzzadást vagy zsugorodást, amikor különböző ozmolalitású külső folyadékoknak vannak kitéve (pl. a sós tengervíztől a híg esővízig) . Bár ezek az ionszállítási mechanizmusok az emlősökben is léteznek, a magasabb rendű szervezetekben a szabályozó “homeosztatikus” funkció nagy részét a sejtek állandó belső környezetének fenntartásával érik el – a Claude Bernard által meghatározott híres “milieu intérieur” vagy “belső tenger” . Ezt nagyrészt a vesék működése révén érik el, összehangolva a plazma térfogatának és koncentrációjának (ozmolalitás) agyi érzékelésével, majd a vizeletbe kibocsátott víz mennyiségének növelésével vagy csökkentésével reagálva. Ezt az alábbiakban részletesebben tárgyaljuk.

A sejtek térfogatának fenntartása mellett a sejtek közötti gyors vízcsere lehetővé teszi a szövetek és szervek számára, hogy fiziológiai működésük részeként vizet szekretáljanak és/vagy felszívjanak. Az egyes vesetubulusokat bélelő epithelsejtek különösen jól alkalmazkodtak ehhez a funkcióhoz, de más szervrendszerek sejtjei is képesek szabályozni a transzepithelialis vízmozgást, hogy lehetővé tegyék a funkcionálisan fontos folyamatok lejátszódását. Például a hasnyálmirigy, az epevezeték, a könny-, a nyál- és az emlőmirigyek, valamint a plexus chorioidea és a retina pigment epithelium által szekretált folyadékok mindegyike gyors transzepithelialis vízmozgással jár.

Hogyan mozog a víz a sejtekbe és a sejtekből?

Az említett élettani folyamatok mindegyike a sejtmembránokon keresztüli vízmozgással jár. Régóta ismert, hogy amikor a legtöbb sejtet desztillált vízbe helyezzük, azok jelentősen megduzzadnak, és végül szétpukkadhatnak. Ezzel szemben, ha a sejteket olyan sóoldatba helyezzük, amely koncentráltabb, mint a citoplazmájukban lévő sók és más összetevők, akkor összezsugorodnak. Ez a folyamat nagyrészt az ozmotikus vízáramlásnak köszönhető, amely egy koncentrációs gradiens felfelé vagy lefelé halad, és amelynek során a rendszer megpróbálja kiegyenlíteni az ozmotikus koncentrációt a sejtplazmamembrán mindkét oldalán. De hogyan is mozog pontosan a víz a sejtmembránon keresztül? Egy speciális, a vörösvértestek duzzadását és zsugorodását mérni képes eszközzel, egy könnyen beszerezhető és manipulálható kísérleti modellel a kutatók arra a következtetésre jutottak, hogy a víznek 2 útvonala van a membránokon keresztül. Amikor az ozmotikus duzzadást és zsugorodást különböző hőmérsékleten követték nyomon, Solomon felfedezett egy lassú, hőmérséklet-érzékeny folyamatot, amely fölé egy sokkal gyorsabb, hőmérséklet-független folyamatot helyezett (1. ábra). A lassú folyamat a víz diffúziós áteresztőképességét tükrözte a plazmamembrán zsíros lipid kettősrétegén keresztül – a diffúzió hőmérsékletérzékeny. A gyors folyamat azonban összhangban volt a vizes pórusok jelenlétével a membránban, ami lehetővé tette a víz gyorsabb, ozmotikusan vezérelt, diffúzióval nem járó átjutását (1. ábra). Macey és Farmer és mások ezután kimutatták, hogy a higanyklorid vegyület jelentősen gátolni tudja ennek a folyamatnak a gyors komponensét, ami egy fehérjepórus – vagy vízcsatorna – jelenlétére utalt a membránban. A higanyklorid a fehérjék szulfhidrilcsoportjaihoz (ciszteinmaradványokhoz) kötődik, és gátolja azok működését: ebben az esetben a vízáteresztő képességet. Így ez a vörösvértestekre összpontosító kutatás egyértelműen igazolta azt az elképzelést, hogy a vízpórusok felelősek a víz gyors, hőmérséklet-érzéketlen, ozmotikusan vezérelt áthaladásáért a biológiai membránokon. Mint látni fogjuk, ezeket a pórusokat később aquaporinokként azonosították.

A vese szabályozza testünk víztartalmát

A vese figyelemre méltó szerv, amely leginkább a vér “szűréséről” ismert a salakanyagok, például a karbamid és más méreganyagok eltávolítása és a vizelet előállítása érdekében. Naponta körülbelül 180 liter vért szűrünk meg, mégis a legtöbb ember csak körülbelül 1,5 liter vizeletet termel. A pontos mennyiség attól függ, hogy mennyit iszunk, milyen meleg van, és mennyit sportolunk (ami izzadással vízveszteséget okoz). A szűrt folyadék mintegy 90%-a a vese proximális régióiban távozik, és ez az érték a legtöbb embernél meglehetősen állandó. A fennmaradó 10% (18 L) azonban az antidiuretikus hormon, a vazopresszin (VP) hatására visszaszívódik a vese gyűjtőcsatornájában. A VP-t a hátsó agyalapi mirigy szabadítja fel dehidratációra (ami a szérum ozmotikus koncentrációjának növekedését eredményezi) vagy térfogatvesztésre válaszul. A vese gyűjtőcsatorna hámsejtjeire egy specifikus receptoron, a vazopresszin-receptoron (V2R) keresztül hat, hogy serkentse a vízvisszaszívást, ami korrigálja a problémát, és visszaállítja a vér koncentrációját és/vagy térfogatát a normális szintre. Az a mechanizmus, amellyel a VP ezt a folyadékfelvételt okozza a gyűjtőcsatorna hámján keresztül, ma már elég jól ismert, és az aquaporin vízcsatornákat érinti.

A varangyos húgyhólyag, mint a vese modellje

Érdemes egy lépést hátralépni, és megvizsgálni, hogyan vizsgálták a VP hatásmechanizmusát kísérleti úton. Bár a VP veseműködésre gyakorolt hatása már jó ideje ismert volt, a VP sejtszintű hatásának részletes feltárásához a vesénél hozzáférhetőbb modellrendszerre volt szükség. Nagyon nehéz (de nem lehetetlen) egyedi vesetubulusokkal dolgozni, mivel azok nagyon kicsik – mindössze 40 µm átmérőjűek. A kutatásban jelentős áttörést jelentett, amikor Bentley (és mások) felfedezték, hogy a varangyok húgyhólyagja is szállít vizet az antidiuretikus hormon hatására. Ez természetes része a vadonban történő túlélési folyamatuknak. Amikor a varangy vízbe merül, a bőrén keresztül vizet vesz fel, és sok, nagyon híg vizeletet termel, amelyet egy nagy, ballonszerű hólyagban tárol. Amikor a varangy korlátozottan jut tóvízhez, és elkezd kiszáradni, saját antidiuretikus hormonja (az úgynevezett vazotocin, a VP analógja) szabadul fel, és a hólyaghámot vízáteresztővé teszi. Így a hólyagban tárolt víz visszakerül a vérbe, hogy rehidratálja az élőlényt. Lényegében a varangy a saját palackozott vizét hordja magával a hólyagjában. A varangyok húgyhólyagja így széles körben használt helyettesítő eszközzé vált a VP által a vese gyűjtőcsatorna hámján keresztül történő vízáramlás vizsgálatára és megértésére.

A varangyhólyagot sok éven át használták a VP-nek a hámsejteken keresztül történő vízáramlásra gyakorolt hatásának kezdetének és eltolódásának vizsgálatára. Számos olyan sejtes jelátviteli útvonalat azonosítottak, amelyek ezt a folyamatot a VP-receptor kölcsönhatás után szabályozzák. A számos varangyhólyag-vizsgálatból származó egyik legérdekesebb eredmény az volt, hogy e hámsejtek plazmamembránjába vízcsatornákat építettek be, hogy növeljék a membrán, és ezáltal a hám vízáteresztő képességét. Hormonmegvonáskor ezeket a “vízcsatornákat” aztán a sejtbe való internalizációval eltávolítják a plazmamembránból (ez az endocitózisnak nevezett folyamat), ami visszaállítja a membrán alapállapotát, és megakadályozza a víz áramlását. Ezt az elképzelést Wade publikálta, aki a NASA űrsiklójával analóg módon a “siklóhipotézis” kifejezést alkotta meg a vízcsatornák oda-vissza mozgásának leírására a sejtfelszínre és a sejtfelszínről. Ezeknek a vízcsatornáknak a természete azonban ismeretlen maradt.

Az aquaporin vízcsatornák felfedezése

A vízcsatornákat alkotó fehérje azonosítására tett számos kísérlet ellenére a terület lényegében hosszú évekre befagyott. Minden irányított kísérlet a fehérje izolálására a varangyhólyagból és a veséből származó eritrociták tisztított membránjaiból korlátozott sikerrel járt, bár néhány publikáció közel járt, mások pedig fontos információkkal szolgáltak, például a molekulaméretre (kb. 30 kD) vonatkozó információkkal . Így történt, hogy az Agre csoport, miközben a vörösvérsejtmembránokban lévő Rhesus-faktor fehérjéket vizsgálta, egy következetes “szennyező” sávot vett észre a géleken 28 kD körül . Ahelyett, hogy elvetették volna ezt az információt, egy kicsit mélyebbre ástak, és arra a következtetésre jutottak, hogy ez lehet a vörösvérsejtekben lévő keresett vízcsatorna. Izolálták és tisztították, és antitestek kimutatták, hogy a vese proximális tubulusainak és a Henle vékony leszálló végtagjának sejtjeiben is kifejeződik – mindkettő konstitutívan erősen vízáteresztő. Ez lehet a vízcsatorna? A döntő pillanat akkor következett be, amikor az Agre csoport ezt a fehérjét kódoló mRNS-t in vitro expressziós rendszerbe, Xenopus oocitákba juttatta. Az oocita membránja normális esetben nagyon vízáteresztő – a petéket édesvízbe helyezik, és ha a membrán áteresztő lenne, szétpukkadnának! A feltételezett vízcsatornát kódoló mRNS befecskendezése után azonban a desztillált vízbe dobott petesejtek pontosan ezt tették – szétrepedtek, míg a kontroll petesejtek épek maradtak. Az Agre csoport rájött, hogy az általuk befecskendezett mRNS arra kényszerítette az oocitákat, hogy egy új fehérjét termeljenek, amely, amikor a sejtek transzportmechanizmusai révén az oocita membránjába került, a membránt a víz számára erősen áteresztővé tette. Nagy ünneplés következett. Egy sor későbbi cikk megerősítette, hogy ez az új fehérje, a CHIP28 (channel-forming integral membrane protein of 28 kD) volt az első véglegesen azonosított vízcsatorna.

Az aquaporin család

Nem sokkal azután, hogy a CHIP28 molekuláris azonossága ismertté vált, mások egy sor homológ fehérjét találtak, amelyek egy új családot alkottak. Aquaporinok néven váltak ismertté . Az elnevezés első használatakor 4 ismert aquaporin volt az emlősökben – az AQP1, 2, 3 és 4 -. Ma már 13 emlős aquaporin létezik, és több százat azonosítottak más szervezetekben, beleértve a növényeket is. Mindegyiknek ugyanazok az általános szerkezeti jellemzői, molekulatömege a nem glikozilált formában körülbelül 30 kD, és több különböző glikozilációs állapot, amelyek nagyobb molekulatömeget eredményeznek. Mindegyiküknek 6 transzmembránon átívelő doménje van; a C- és az N-terminus egyaránt a citoplazmában van; a lipid kettősrétegben funkcionális tetramert alkotnak, és a fehérjén belüli vízpórus szerkezetét néhány aquaporin esetében röntgenkrisztallográfiával tisztázták . Váratlanul egyes aquaporinok vízáteresztőbbek, mint mások, és egyesek a vízen kívül más molekulákat is képesek szállítani. Például az AQP3 permeábilis a glicerinre, az AQP9 pedig a karbamidra. Ezenkívül néhány aquaporin permeábilis az olyan gázokra is, mint a CO2 és az NO . Így az akvaporin biológia területe folyamatosan bővül, és rendszeresen érkeznek jelentések új és váratlan funkciókról a különböző sejtekben és szövetekben.

Aquaporin 1 és 2 (a VP érzékeny vízcsatorna) a vesében

AQP1, a vörösvértestek vízcsatornája, nagymértékben expresszálódik a proximális tubulusokban és a Henle vékony leszálló végtagjaiban, amelyek mindketten mindenkor erősen vízáteresztőek . Ezek a tubulussegmensek a szűrt víz 90%-ának reabszorpciójában vesznek részt. Egy második aquaporint, az AQP2-t a vese gyűjtőcsatorna fő sejtjeiben azonosították. Ezek azok a sejtek, amelyek (a varangyhólyaghoz hasonlóan) az antidiuretikus hormon, a VP hatására változtatják vízáteresztő képességüket, és így szabályozzák a maradék folyadék – napi közel 20 liter – visszaszívását. Az AQP2 a VP által szabályozott vízcsatorna. VP jelenlétében az AQP2 felhalmozódik a fősejtek felszínén, és a víz egy ozmotikus gradiens által hajtva áthalad a hámon (2. ábra). E tubulusok bazolaterális oldala hipertonikus a tubulusok lumenében lévő folyadékhoz képest, és a víz VP jelenlétében e gradiens mentén áramlik lefelé. A fősejtek bazolaterális membránja mindig vízáteresztő az AQP3 vagy az AQP4 jelenléte miatt a vese különböző részein . Így az AQP2 mennyisége az apikális membránban az a sebességkorlátozó tényező, amely szabályozza a vízvisszaszívást a vese gyűjtőcsatornájában. Sokéves kutatások kimutatták, hogy az AQP2 a fősejtekben a plazmamembrán és a citoplazmatikus vezikulák között cirkulál, és a VP úgy változtatja meg az egyensúlyt, hogy több AQP2 halmozódik fel a sejtfelszínen, és kevesebb van a sejt belsejében, ami a membránpermeabilitás növekedését okozza (2. ábra). A folyamat hátterében álló sejtbiológia részben érthető, és egy jelátviteli kaszkádot foglal magában, amelyet a VP receptorával való kölcsönhatása, az adenil-cikláz aktiválása az intracelluláris cAMP növelésére, a protein-kináz A aktiválása és az AQP2 fehérje foszforilációja indít el. A foszforiláció az a kritikus esemény, amely az AQP2 membránfelhalmozódását okozza, és több laboratórium is részt vesz a folyamat további megértését célzó vizsgálatokban. Az érdeklődő olvasó figyelmébe ajánljuk a folyamatról nemrégiben megjelent részletes áttekintéseket .

Az aquaporinok patofiziológiája

Amint az várható volt, az aquaporinok számos betegségben szerepet játszanak, leginkább a vesében (3. ábra). Az AQP2 vagy gyakrabban a V2R hibás működése vagy mutációi nefrogén diabetes insipidust (NDI) okoznak, amelyben a betegek nem képesek koncentrálni a vizeletüket, és elméletileg naponta akár 18 liter híg vizeletet is üríthetnek, azaz a gyűjtőcsatornában normálisan visszaszívódó mennyiséget. Más kompenzációs mechanizmusok miatt a legtöbb NDI-s beteg napi 5 és 10 l közötti mennyiséget termel. A rendelkezésre álló terápiák csak részben képesek enyhíteni a tüneteket, és további munkára van szükség a jobb gyógymódok megtalálásához. Az NDI leggyakoribb oka a bipoláris zavar miatt lítiumkezelésben részesülő betegeknél fordul elő. A lítium az AQP2 gén súlyos downregulációját okozza, amelynek okai nem teljesen tisztázottak . Bár a bipoláris zavar nagyon hatékony terápiája, ez és más mellékhatások miatt sok beteg vonakodik a lítiumterápiától. Más AQP-vel kapcsolatos rendellenességek, amelyeket többnyire knockout állatmodellekben azonosítottak , a vizeletkoncentrációs rendellenesség (AQP1 embereket azonosítottak), a szürkehályog (AQP0), a stroke (AQP4) és a hibás hidratáció miatti törékeny bőr (AQP3). Az AQP1 és az AQP2 a sejtvándorlásban és a sebgyógyulásban is szerepet játszik. Végül az aquaporinok vonzereje megragadta a reklámügynökségek fantáziáját, például a kozmetikai iparban. Guglizzon rá és meglátja!

Jövőbeli irányok

Az aquaporin biológia egyik izgalmas területe e csatornafehérjék úgynevezett holdfény-funkcióinak megjelenése. Ezek kapcsolódhatnak a csatornafunkciójukhoz, mint az AQP1 gázáteresztő képessége, vagy függetlenek a csatornaaktivitástól, mint az AQP2 esetében, amely az integrinekkel és az extracelluláris mátrixszal való kölcsönhatásán keresztül részt vesz a vese fejlődésében . A jövőbeni vizsgálatok kétségtelenül az aquaporinok további váratlan tulajdonságait fogják azonosítani. Számos aquaporin található nem emlős “alacsonyabb” fajokban, például növényekben, mikrobákban és gombákban. Ez megnyitja az utat arra, hogy ezt az információt felhasználjuk a növények növekedésének és alkalmazkodásának javítására az AQP működésének serkentésével, valamint a mikrobiális és gombás fertőzések elleni küzdelemre az aquaporinok gátlásával. Ilyen specifikus gátlók még nem állnak rendelkezésre, de ha és amennyiben kifejlesztik őket, fontos szerepük lehet az orvostudományban is, mint akvapinoknak (a magas vérnyomás kezelésére), és talán a rákban (az áttétképződés megakadályozására). Az aquaporin-forgalom sejtbiológiájáról is sokat kell még tanulnunk. Hogyan mozognak a sejtben? Hogyan lépnek kölcsönhatásba más fehérjékkel? Lehet-e alternatív jelátviteli utakat azonosítani és kihasználni a hibás V2R jelátvitel megkerülésére az NDI-ben? Ez a munka folyamatban van, és azt ígéri, hogy olyan sejttitkokat tár fel, amelyek nemcsak az AQP-k biológiájára vonatkoznak, hanem más fontos sejtmozgási eseményekre is, amelyek számos más emberi betegségben is szerepet játszanak.

Acknowledgements/Disclosure Statement

D.B. és az MGH Program in Membrane Biology munkatársai folyamatos támogatást kaptak az aquaporinokkal kapcsolatos munkájukhoz a National Institutes of Health-től, jelenleg a DK096586 számú támogatással. D.B. a Danone Research-től a H4H tudományos konferencián való részvételhez az utazási költségek és a regisztrációs díj megtérítését kapta.

A szerzői kapcsolatok

Cikk/közlemény részletei