PMC

TEXT

A streptococcusok az emberi száj legelterjedtebb lakói (6, 24), és gyakran jutnak a véráramba a periodontális elváltozásokon vagy a rutinszerű tevékenységek során keletkezett szájüregi horzsolásokon keresztül (32). Ez súlyos betegségekhez vezethet, beleértve a fertőző endokarditiszt (IE) (28) és a neutropenikus bakterémiát (29). A szájüregi streptococcusok taxonómiája régóta zavart okoz (4, 9, 20, 22, 31). A 16S rRNS-gén szekvenálása nagymértékben tisztázta a helyzetet (13); ez a megközelítés azonban nem elég érzékeny ahhoz, hogy bizonyos közeli rokon fajokat, köztük a Streptococcus mitis-t és a Streptococcus oralis-t (12) meg lehessen különböztetni, illetve hogy lehetővé tegye a törzsek tipizálását vagy a fajon belüli filogenetikai elemzést. Ezért nagyobb variabilitással rendelkező géneket vizsgáltak, beleértve a 16S-23S rRNS intergenikus transzkripciós spacert (ITS) (2), fehérjéket kódoló háztartási géneket (1, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 23) vagy mindkettőt (17, 18). Az e célokra legjobban alkalmas gén(ek) tekintetében még nem alakult ki konszenzus. Továbbá, bár korábbi tanulmányok azonosították az orális streptococcusokat klinikai vértenyészetekből végleges szekvenálási módszerekkel (12, 23, 30), egyik sem számolt be részletes klinikai információkról az alapbetegségről. Mi mindkettőre vállalkoztunk.

A Virginia Commonwealth University Medical Center kórházában 2003 májusa és 2008 májusa között végzett véráramtenyészeteket a klinikai mikrobiológiai laboratórium feltehetően streptococcusokat tartalmazónak azonosította. A nem orális fajok kizárására számítógépes szkriptet használtak. A szennyeződések elemzésének elkerülése érdekében csak akkor kértek izolációs lemezeket, ha két vagy több jelentés ugyanazon beteg különálló tenyészeteiből származott. Minden rendelkezésre álló izolációs lemezről egy-egy kolóniát tenyésztettek tenyésztenyészetben, majd makroszkóposan és mikroszkóposan megvizsgálták. Ha az ugyanattól a betegtől származó különálló tenyészetekben bármilyen különbséget észleltek, mindkét tenyészetet megtartották. Ellenkező esetben minden betegből egyetlen tenyészetet kriokonzerváltunk, és aliquotokat vettünk ki a PCR-amplifikációhoz.

Az egyes izolátumok faji azonosságának és filogenetikai rokonságának meghatározásához a 16S-23S ITS-t a korábban leírt 6R és 13BF primerekkel amplifikáltuk (2). Amikor egyes izolátumokból nem kaptunk termékeket, megállapítottuk, hogy a 6R primer utolsó három nukleotidja nem illeszkedik a GenBankban található 23S rRNS-szekvenciákhoz, amelyek több érdekes fajból származnak. Ezért lerövidítettük és egyszerűsítettük a 6R primert, létrehozva a 6R-S-t, és lerövidítettük a 13BF primert, hogy megfeleljen az annealing-hőmérsékletének (lásd a kiegészítő anyag S1. táblázatát). A 6R primer hasonló módosításáról nemrégiben számoltunk be (18). Ezeket a primereket használva minden izolátumból PCR-amplikonokat nyertünk, amelyeket kapilláris DNS-szekvenciaelemzésre küldtünk be.

A legtöbb DNS-szekvencia tartalmazta a teljes ITS-t és a 16S és 23S rRNS-gének egy részét, amelyeket összehangoltunk a GenBankban elérhető, vagy általunk az American Type Culture Collection (ATCC) törzsekből származó ITS-szekvenciákkal. Megállapítottuk, hogy a flankáló 16S és 23S szekvenciák, bár a legtöbb publikált szekvenciában nem maradtak meg, megkönnyítették az ITS összehangolását. Valójában legalább négy olyan típustörzs szekvenciát publikáltak (18), amelyekben a 16S rRNS gén 3′ vége előtt 78 bp-mal elhelyezkedő CTAAGG-t úgy tűnik, hogy összetévesztették egy azonos hexanukleotid szekvenciával, amelyet korábban (2) az ITS kezdeteként határoztak meg. A trimmelt ITS-szekvenciákat (2) ezután összehasonlítottuk és összehangoltuk a MEGA 4 szoftverrel (25), hogy szomszéd-összekötő filogenetikai fát építsünk (1. ábra).

Korábban azt javasolták, hogy az ITS-elemzés önmagában elegendő a szájüregi streptococcusok fajazonosításához, beleértve a közeli rokonságban álló S. mitis és S. oralis fajokét is. Két helyen konzervált egybázisú deléciókat és összesen 246 bp hosszúságú ITS-t javasoltak a S. oralisra jellemzőnek, míg a S. mitis esetében a deléciók hiányát és 248-249 bp hosszúságú ITS-t javasoltak (2, 3). Vizsgálatunkban mindkét fajból találtunk olyan izolátumokat, amelyek mindkét delécióval vagy egyik delécióval sem rendelkeztek, valamint átfedő ITS-hosszúsággal. Így a S. oralis és a S. mitis izolátumokat nem lehetett megbízhatóan megkülönböztetni e kritériumok alapján. Egy másik tanulmány szerint az ITS-szekvenciaelemzés, bár nem elegendő az S. oralis és az S. mitis megkülönböztetéséhez, elegendő számos más orális streptococcus faj, köztük az anginosus csoportba tartozó fajok azonosításához (18). Az anginosus csoportba tartozó S. intermedius fajból azonban találtunk egy olyan izolátumot (VMC38), amelyet nem lehetett ITS-szekvencia alapján besorolni (lásd a kiegészítő anyag S1. táblázatát).

Nagyszámú izolátum, különösen a S. mitis és a Streptococcus constellatus esetében, szintén azonos szekvenciákkal rendelkezett, ami kizárta a filogenetikai elemzést. Azonos szekvenciákat kaptunk öt, ugyanazon betegektől származó izolátumpárból is (az adatok nem láthatóak).

Mivel az ITS-elemzés nem volt elegendő a céljainkhoz, szekvenáltunk egy második közös célpontot – a mangánfüggő szuperoxid-dizmutázt kódoló sodA gént (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Ez lehetővé tette több izolátum kizárását. A fent említett, azonos alanyoktól származó és azonos ITS-szekvenciákkal rendelkező törzspárok azonos sodA-szekvenciákkal is rendelkeztek, ami megerősítette, hogy az izolátumok azonosak, és minden párból egy izolátumot kizártunk. Két izolátumot a törzsek kezelésében elkövetett nyilvánvaló hiba miatt hagytak ki, egy másikat pedig azért nem tartottunk meg, mert az ITS- és a sodA-szekvenciák azt mutatták, hogy az Enterococcus faecalis törzséről van szó. A megmaradt izolátumokból származtatott filogenetikai fa az 1. ábrán látható.

A filogenetikai elemzéshez a sodA illesztés jobb volt, mint az ITS. Az egyetlen olyan izolátum, amelynek sodA-szekvenciája azonos volt, két S. mitis törzs és két Streptococcus vestibularis törzs volt. A sodA összehangolás a fajmeghatározás szempontjából is hasznosabb volt. Az összes referencia törzs jól elkülönült egymástól a filogenetikai fán. Az eredmény mindössze négy kétértelmű fajmeghatározás volt a sodA esetében, míg az ITS esetében 15 (lásd a kiegészítő anyag S1. táblázatát). Azokban az esetekben, amikor egyetlen fajmegjelölés összhangban volt mind az ITS-, mind a sodA-szekvenciákkal, ezt a megjelölést használtuk. A végső 58 klinikai izolátum közül csak 3 nem volt biztonságosan azonosítható ezzel a módszerrel. A VMC1 és VMC43 izolátumok az ismételt szekvenálási kísérletek ellenére túl rövid ITS-szekvenciákat produkáltak ahhoz, hogy informatívak legyenek, a VMC58 pedig az ITS- és a sodA-szekvenciák alapján ellentmondásosan volt azonosítható (1. ábra; S1. táblázat). Ezen izolátumok faji azonosságát egy nemrégiben közzétett adatbázis segítségével erősítettük meg, amely 420 jól jellemzett sztreptococcustörzs hét háztartási génjének szekvenciáit tartalmazza, köztük a sodA, a pfl és a pyk szekvenciáit (1). A pfl és/vagy pyk gének szekvenciáit minden megkérdőjelezhető törzsből meghatároztuk és összehangoltuk az eMLSA.net adatbázisban (http://www.emlsa.net/) található szekvenciákkal, akárcsak a meglévő sodA szekvenciákat. A pfl- és pyk-fajok hozzárendelése minden esetben megegyezett a sodA-ból származóval. Ezenkívül a sodA összehangolás azt jelezte, hogy a VMC58 szekvencia, bár eltér a típustörzstől, az adatbázisban szereplő 13 Streptococcus infantis izolátumból álló klaszterbe tartozik (az adatok nem láthatóak). A vizsgálatba bevont összes izolátum konszenzusos fajazonosítását az 1. ábra és a kiegészítő anyag S1 és S2 táblázata tartalmazza.

Míg ezek az eredmények arra utalnak, hogy a sodA analízis önmagában elegendő a legtöbb törzs azonosításához, javasoljuk, hogy minden törzs esetében legalább egy további fehérjét kódoló házőrző gén felvételét. Számos orális streptococcus természetes módon kompetens, és beszámoltak olyan esetekről, amikor idegen házvezető gének, köztük a sodA, kerültek átvételre (1, 12). A mi vizsgálatunkban ez nem volt nyilvánvaló, de volt példa kiméra ITS (VMC38 és VMC50) és sodA (VMC33) szekvenciákra. Két közelmúltbeli publikáció ennél is tovább ment, mindkettő a hét házvezető gén különböző készletének szekvenálását javasolja a multilokális szekvenciatipizáláshoz (7) vagy a multilokális szekvenciaelemzéshez (1). Ezek a megközelítések nagyobb számú gén elemzésén alapulnak, hogy nagyobb felbontást biztosítsanak, és minimalizálják az esetenként előforduló kiméra vagy idegen gének hatását (1, 7). Ezek a rendszerek kifinomultabb filogenetikai elemzéseket is lehetővé tesznek, mint ami csak két vagy három gén esetében lehetséges. Alkalmanként azonban nehézségeket tapasztaltunk a pfl és a pyk amplifikálása és szekvenálása során, és kevés sikerrel jártunk a másik két ajánlott gén, a map és a ppaC esetében (1). Egy másik, nemrégiben végzett vizsgálat hasonló nehézségekről számolt be (27). Így a további gének kiválasztása empirikus tesztelést igényelhet, de a hét génből álló elemzésekben alkalmazottakat érdemes először megvizsgálni, mivel jól jellemzett törzsek szekvenciáinak nagy gyűjteményei állnak rendelkezésre az összehasonlításhoz (1, 7).

Tudomásunk szerint ez csak a második jelentés Streptococcus australis (12) vagy S. infantis (30) vérkultúra izolátumról. Az utóbbi fajnak az egyetlen másik, bármilyen betegséggel való összefüggése két jelentésből származik, amelyekben cisztás fibrózisban szenvedő felnőttek köpetéből izolálták (17, 26). Ezért érdekes, hogy egy cisztás fibrózisban szenvedő felnőtt volt a mi S. infantis izolátumunk, a VMC58 forrása (lásd a kiegészítő anyag S2. táblázatát).

Az S2. táblázat tartalmazza az antibiotikum-érzékenységi adatokat, amelyek nagyrészt összhangban vannak a korábbi vizsgálatokkal (8). Az S2. táblázat a forrásbetegek klinikai és demográfiai adatait is tartalmazza, kategorizálva őket a fő alapbetegség alapján: orvosi betegség, rosszindulatú daganatos betegség, IE vagy műtét/trauma. Az összes IE-beteget klinikai diagnózissal diagnosztizálták, és a VMC56-os esetet (S2. táblázat) kivéve valamennyi esetet a módosított Duke-kritériumok (16) alapján “biztos IE”-nek minősítették. Az egyetlen kivételnek korábbi IE és intravénás kábítószer-használat (IVDU) volt a kórtörténetében, ami a pozitív vértenyésztéssel együtt a “lehetséges IE” kategóriába sorolást eredményezte. A lehetséges fertőzési forrásokra vonatkozó adatokat, beleértve a centrális vezetékeket, a gasztrointesztinális endoszkópiát, a szájnyálkahártya-gyulladást, a fogászati állapotokat és az IVDU-t, szintén megvizsgálták. A 13 IE-beteg közül 9-nél találtak IVDU-t, és a vizsgálatban csak 1 másik betegnél (S2. táblázat). Ez a különbség statisztikailag szignifikáns volt (P < 0,0001; Fisher pontos tesztje). Így, bár ez a vizsgálat az orális fajokra összpontosított, az IVDU elsöprő kockázati tényező volt.

A filogenetikai elemzésünk nem tárt fel statisztikailag szignifikáns összefüggést egyetlen faj vagy klóntípus és az alapbetegség vagy más klinikai paraméterek, köztük a fehérvérsejtszám, a legmagasabb hőmérséklet, a vegetáció mérete, az érintett billentyű vagy a beteg halála között. Egy korábbi tanulmány elegendő információt tartalmazott a neutropeniás betegekből izolált fajok azonosításához (12). Eredményeink hasonlóak voltak, mivel az említett vizsgálatban 12 izolátumból 11, a miénkben 10-ből 9 (S2. táblázat) vagy S. mitis, vagy a közeli rokon S. oralis volt. Vizsgálatunkban e két faj együttesen szignifikánsan nagyobb valószínűséggel izolálódott neutropeniás betegekből, mint a fennmaradó 12 faj együttvéve (P = 0,004; Fisher egzakt tesztje). Ez tükrözheti e fajok prevalenciáját a szájüregben. Érdekes azonban, hogy ez a tendencia nem terjedt át az IE-re. Ha a neutropeniára és az IE-re vonatkozó adatainkat összevetjük az ugyanebből a vizsgálatból (12) származó adatokkal, a S. oralis és a S. mitis 22 neutropeniás esetből 20-ból, míg 27 IE esetből csak 15-ből izolálódott, ami statisztikailag szignifikáns különbség (P = 0,01; Fisher egzakt tesztje). A korábbi tanulmányokhoz hasonlóan (11, 12, 30) a mintaszámok korlátozták a faj és az egyes betegségek vagy klinikai jellemzők közötti egyéb lehetséges összefüggések magabiztos értékelésének lehetőségét. A végleges fajazonosításnak az egyes forrásbetegek klinikai és demográfiai jellemzőivel való párosításával (S2. táblázat) azonban arra törekedtünk, hogy eredményeinket alkalmassá tegyük metaanalízisre vagy más, kombinált adatokat felhasználó vizsgálatokra.

.