Plaque Assay

A plaque assay használható a vírus klonális populációjának tisztítására vagy a vírustiter meghatározására plaque-képző egység/ml-ben (pfu/ml), hogy a későbbi munkák során ismert mennyiségű vírus használható legyen a sejtek megfertőzésére. Ebben a vizsgálatban a sejtmonorétegeket alacsony arányú vírussal fertőzik, úgy, hogy a szórványos sejtek is megfertőződnek. Az agarózréteg stabilan tartja a sejteket és korlátozza a vírus terjedését. Amikor minden fertőzött sejt vírust termel és végül lizálódik, csak a közvetlenül szomszédos sejtek fertőződnek. A fertőzött sejtek minden egyes csoportját plakknak nevezzük. A nem fertőzött sejtek körülveszik a plakkokat. Több fertőzési ciklus után a plakkok közepén lévő fertőzött sejtek lízisbe kezdenek, és a perifériás fertőzött sejteket továbbra is nem fertőzött sejtek veszik körül. E jelenség hatására a fertőzött sejteken áthaladó fény másképp törik meg, mint a környező nem fertőzött sejtek, és a plakk szabad szemmel vagy fénymikroszkópiával is láthatóvá tehető. Minden egyes plakk egyetlen vírust képvisel. Ezért a klonális víruspopulációkat az egyes plakkok izolálásával lehet tisztítani. A vírusállomány különböző hígításaiból nyert egyedi plakkokat meg lehet számolni az adott transzfekció vagy vírusállomány vírustiterének (pfu/ml) meghatározásához. A sejtek állapota és egyenletes eloszlásuk a szövettenyésztő lemez felületén fontos a plakkvizsgálat sikeréhez. A sejteknek egészségesnek, > 95%-ban életképesnek és log-fázisban lévőnek kell lenniük a vizsgálat időpontjában. A csomós sejtek, a nem a megfelelő sűrűségben (>70%) egyenetlenül eloszló sejtek a lemezen, valamint azok a sejtek, amelyek nem tapadnak a szövettenyésztő edényekhez a lemezbe helyezést követő 30 percen belül, károsak a vizsgálat szempontjából.

Szükséges további anyagok:

Plaque Assay Agarose, Cat. No. 554766
Grace’s Unsupplemented Insect Cell Medium
Fetal Bovine Serum
Tissue Culture Dish, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
42°C-os vízfürdő

Protokoll

Meghatározzuk a szükséges lemezek számát

Minden ko-transzfekcióhoz vagy vírusállományhoz (és pozitív kontrollhoz) készítsünk duplikált sorozathígításokat (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Címkézzünk fel minden 60 mm-es lemezt a minta és a hígítás leírásával.

Vetünk be tenyészlemezt rovarsejtekkel

1. Vetünk be 2,3 x 10 6 Sf9 sejtet minden 60 mm-es lemezre. Óvatosan ringassuk a lemezeket előre-hátra, majd egyik oldalról a másikra, hogy a sejtek egyenletesen eloszoljanak a lemez felületén. Soha ne forgassa a lemezt; ez a sejtek egyenetlen eloszlását okozza. Miután a lemezeket beültettük, hagyjuk a sejteket 30 perctől egy óráig megtapadni. Ez idő alatt készítse el az agaroldatot és a vírushígításokat. Fénymikroszkóppal vizualizáljuk, hogy megerősítsük a >70%-os konfluenciát és az egyenletes sejteloszlást.

Agarózoldat elkészítése

A lemezre helyezett sejteket 1%-os agarózoldattal fedjük le Grace’s Insect Cell Mediumban, 10% FBS-szel kiegészítve.

1. Először egyenlítsük ki a vízfürdőt 42°C-ra. Határozza meg a szükséges agaroldat teljes térfogatát: szorozza meg a 4 ml/lemez mennyiségét a plakkpróbák számával. Ennek a teljes térfogatnak az egyik fele autoklávozott dH 2 O + agaróz lesz, hogy 2%-os oldatot kapjunk, a másik fele pedig Grace’s Insect Media lesz 10% FBS-szel kiegészítve. A végső 1%-os agarózoldat elkészítéséhez szükséges plakk-teszt agaróz grammban kifejezett mennyiségének meghatározásához szorozza meg a teljes térfogatot 0,01-gyel. (Például 10 lemez x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 g.)
2. Adja hozzá a megfelelő mennyiségű autoklávozott dH 2 O-t egy megfelelő méretű steril üvegpalackba. Ezután LASSAN adjuk hozzá a kiszámított mennyiségű agarózt, miközben óvatosan kevergetve keverjük össze a dH 2 O-t és az agarózt. Mikrózza az elegyet, amíg éppen csak forrni nem kezd. Vegye ki a palackot, és vizsgálja meg a keveréket, hogy nincs-e benne oldatlan agaróz. Ha van benne, folytassa a melegítést. Ismételje ezt addig, amíg az agaróz teljesen fel nem oldódik (VIGYÁZAT: a keverék és a kísérő gőz nagyon forró, és égési sérüléseket okozhat. Használja a megfelelő védőfelszerelést/elővigyázatossági intézkedéseket). Ha az agaróz teljesen feloldódott, lazán zárja le a palackot, és helyezze át a 42 °C-os vízfürdőbe. Hagyja a keveréket 42°C-ra lehűlni.
3. Vegye meg a Grace’s Insect Media-t, és adjon hozzá 10% magzati szarvasmarha-szérumot. Példa: 100 ml Grace’s Insect Media-hoz adjunk 10 ml FBS-t. Helyezze a Grace’s media + 10% FBS keveréket a 42°C-os vízfürdőbe.

Készítsen vírusos sorozathígításokat

1. Minden egyes ko-transzfekcióhoz címkézzen fel hat 15 ml-es steril csövet 10 -1-től 10 -6-ig a megfelelő minta leírásával. Adjunk minden egyes csőbe 2,7 ml TNM-FH médiumot. Adjunk 0,3 ml ko-transzfekciós felülúszót az első csőbe, vortexeljük a csövet. Végezze el a sorozatos hígításokat úgy, hogy a következő hígításhoz 0,3 ml-t ad át, minden alkalommal új pipettát használva.

Infektálja a monolayer sejteket

1. A sejteknek ekkor már elegendő ideje volt a lemezfelülethez való tapadásra. Ellenőrizzen több lemezt fénymikroszkóp alatt, hogy megerősítse a 70%-os konfluenciát és a sejtek egyenletes eloszlását.
2. Az egyes hígítások duplikált lemezeivel dolgozva, steril 200 µl-es pipettahegy és vákuum segítségével óvatosan szívja le a sejtekről a médiumot. Ne szakítsa meg a sejtlapot. Adjon 1 ml-t a megfelelő vírushígításból mindegyik duplikált lemezhez, és óvatosan ringassa a lemezt előre-hátra, majd oldalra-oldalra a vírus egyenletes eloszlása érdekében. Ismételje meg az összes megfelelő lemezzel és hígítással.
3. Lágyan ringassa a lemezeket szobahőmérsékleten, steril motorháztetőben 15 percenként 1 órán keresztül.

Fertőzött sejteket agarózzal

1. 1 óra elteltével ellenőrizze, hogy az agarózoldat 42 °C-os. Az oldatnak elég melegnek kell lennie ahhoz, hogy még folyékony állapotban legyen, de elég hűvösnek kell lennie ahhoz, hogy kézzel megfogható legyen. Ha nem tudja kényelmesen megfogni a palackot, az oldat túl forró, és elpusztítja az Sf9 sejteket. Győződjön meg róla, hogy a Grace’s Insect Media w/ 10% FBS 42°C-os. Ha igen, adjon hozzá ugyanekkora mennyiséget az agarózoldathoz, hogy teljes legyen a végleges agaroldat. Keverje jól össze a végleges agaroldatot.
2. Mihelyt az oldat elkészült, helyezze a vízfürdőből származó vízzel töltött üvegpohárba. Ez megakadályozza, hogy az oldat megszilárduljon, amíg a motorháztető alatt használja. Az eljárás során rendszeresen ellenőrizze a főzőpohárban lévő víz hőmérsékletét. Ha kezd lehűlni, cserélje ki a vízfürdőből származó meleg vízzel.
3. Egyszerre egy pár duplikátummal dolgozva óvatosan szívja le a sejtekről a tápfolyadékot egy steril 200 µl-es pipettahegy és vákuum segítségével. Ne szakítsa meg a sejtlapot. A szívás közben enyhén billentse meg a lemezt, és vákuumozza ki a felülúszót a lemez széléről. Ez lehetővé teszi az optimális szívást a sejtlap megzavarása nélkül. Ezután lassan adjon 4 ml agaroldatot minden egyes lemezhez, és hagyja, hogy az agar megszilárduljon.
4. Mihelyt az agar minden lemezen megszilárdult, óvatosan helyezze a lemezeket egy tiszta, légmentes inkubációs kamrába. Párásítsa a kamrát úgy, hogy steril gézt és 10 ml steril vizet helyez egy 10 mm-es tenyésztőedénybe az inkubációs kamra alsó állványára. Zárjuk le a kamrát, és helyezzük 27 °C-os inkubátorba. Hagyja a lemezeket 6-10 napig inkubálni.
5. A lemezeket sötét háttérre fordítva és a lemez oldaláról erős fényforrással megvilágítva, vagy 45°-os szögben fényforrásba tartva láthatóvá lehet tenni. Amikor megtanulja a plakkok azonosítását, jelölővel karikázza be a lehetséges plakkokat. Fénymikroszkóppal, kis teljesítményen vizualizálva erősítse meg, hogy a sejtek gyepében van-e tisztuló terület. Vizualizáljon nagy fényerőn, hogy fertőzött sejteket keressen a tisztás perifériáján, majd a tisztás területétől távolodva egyre kevesebb fertőzött sejtet.
6. A plakkok vizualizálásának megkönnyítése érdekében fedje le 3 ml 0,5%-os agarózzal (a korábban leírtak szerint elkészítve), amely 50 µg/ml semleges vöröset tartalmaz. (Készítsen semleges vörös (Sigma N7005) törzsoldatot 1 mg/ml-ben vízben vagy PBS-ben. Szűrje-sterilizálja és tárolja 4°C-on, sötétben). Hagyja megkeményedni és inkubálja a lemezt egy éjszakán át 27°C-on. A semleges vörös megfesti az egészséges sejteket, és a plakkok fehér háttér előtt kb. 0,5-3 mm átmérőjű tiszta területként jelennek meg. Mivel a semleges vörös egy létfontosságú festék, fontos, hogy a festést akkor végezzük, amikor a sejtmonoréteg egészséges, azaz 4-7 nappal a fertőzés után.

Plaque-tisztítás vírusállományból

A megfelelő izolálás biztosítása érdekében a legjobb, ha a plaque-okat 50-nél kevesebb plaque-ot tartalmazó lemezekről vesszük. A vírusból több hígítást kell lemezt készíteni, hogy elegendő számú plakkot kapjunk. A plakkokat steril mikropipettahegyekkel (1000 µl) vagy mikrokapilláris csövekkel lehet felvenni.

Vírusszaporítás plakkszedésből

1. Megjelöljük a plakk alatti lemezt egy jelölővel. Steril pipettahegy segítségével távolítson el egy agarózdugót közvetlenül a plakk felett. Vegyen ki 10-100 plakkot ilyen módon.
2. Tegyen minden agarózdugót egy külön mikrocentrifugacsőbe, amely 1 ml szövettenyésztő tápfolyadékot tartalmaz. A vírusrészecskéket a cső egy éjszakán át 4°C-on történő forgatásával eluáljuk ki az agarózból.
3. Adjunk 200 µl-t minden egyes plakkszedésből egy 12 lyukú szövettenyésztő lemez külön lyukaiba, amelyekbe lyukanként 2 x 10 5 sejtet vetettünk 1 ml friss TNM-FH médiumba. Inkubáljuk a lemezeket 3 napig 27°C-on.
4. A vírus felülúszóját ebből a passage-one állományból fel lehet gyűjteni és 5 percig 1000 x g-nél 4°C-on centrifugálni a törmelék eltávolítása érdekében. Tároljuk 4°C-on.
5. Vetünk be egy 100 mm-es szövettenyésztő lemezt 5 x 10 6 sejtekkel minden egyes plakkizolátumhoz. Hagyja, hogy a sejtek rögzüljenek, és cserélje ki a táptalajt 10 ml friss TNM-FH táptalajra.
6. Adjon 200 µl átjáró 1-es törzsanyagot a 100 mm-es lemezhez, és inkubálja 27°C-on 4 napig. A fennmaradó 800 µl passage-one törzsanyagot tegye félre 4°C-on tartalékként.
7. Vegye le a vírusos felülúszót, és centrifugálja a törmelék eltávolításához. Határozza meg ennek a második passzázs-kettes állománynak a titerét. Ha a titer 2 x 10 8 pfu/ml alatt marad, folytassuk a baculovírus-amplifikációval.