Könyvespolc

A peptidek biogenezisében részt vevő enzimek nagy részét már azonosították

A 18-5. ábrán a prekurzorok feldolgozásának leggyakoribb lépései és a résztvevő enzimek láthatók. Az érintett endoproteázok a prohormon-konvertáz 1 és 2 (PC1 és PC2), az exopeptidáz a karboxi-peptidáz E (CPE, más néven CPH és enkefalin-konvertáz), az α-amidáló enzim pedig a peptidil-glicin α-amidáló mono-oxigenáz (PAM). Bioszintézisük számos lépése nem csak a neuropeptidekre jellemző, mint például a jelzőpeptidek hasítása, a diszulfidkötés kialakulása, az N- és O-kötésű oligoszacharidok hozzáadása és későbbi módosítása, a foszforiláció és a szulfatálás. Amint azt a 18-3. ábra mutatja, a poszttranszlációs lépések közül sok akkor történik, amikor az érlelődő neuropeptidek az axonon lefelé haladnak az LDCV-kben a szinapszis felé. A neuropeptid-bioszintézis későbbi lépései (18-5. ábra) csak a neuronokra és az endokrin sejtekre jellemzőek.

A neuropeptid-bioszintézis kulcsenzimei közé tartoznak az endoproteázok, exoproteázok és a peptidek végeit módosító enzimek. A Kex2p, az élesztő pro-α-párzási faktort a feromon α-párzási faktor négy példányának előállítása érdekében hasító endoproteáz felfedezése és jellemzése (18-2. ábra) kulcsfontosságú volt az emlősök prohormon-konvertázainak, köztük a furin, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC és PACE4 felfedezéséhez. A prohormon-konvertázok homológiája megegyezik a bakteriális szubtilizinekkel, és Asp-His-Ser katalitikus triáddal rendelkeznek, amely a katalízisben részt vevő három kulcsfontosságú aminosavból áll (a 18-5. ábrán D, H és S jelöléssel). Mindegyikük prorégiójának (18-5. ábra) jelen kell lennie a bioszintézis során ahhoz, hogy a proteáz megfelelően összecsukódjon, de az aktivált proteáz előállításához el kell távolítani. A PC1 és a furin esetében a prorégió eltávolítása a bioszintézist követő néhány percen belül történik, miközben az enzim az endoplazmatikus retikulumban van, és valószínűleg autokatalitikus esemény. A többi prohormon-konvertáz esetében a prorégió eltávolítása sokkal lassabban történik. Az aktív PC2 expressziójához a 7B2 peptid koexpressziója szükséges (18-5. ábra), amely úgy tűnik, hogy chaperon funkciót tölt be, és megakadályozhatja a PC2 endoproteolitikus aktivitásának expresszióját is, amíg a PC2 le nem rakódik a szekréciós granulumokba. A többi prohormon-konvertáz esetében nem azonosítottak megfelelő chaperon/inhibitor peptidet.

A neuropeptid-feldolgozásban legegyértelműbben részt vevő emlős endoproteázok a PC1 és PC2, a szekréciós granulumokban található Ca2+-függő proteázok, amelyek expressziója a neuronokra és az endokrin sejtekre korlátozódik (18-5. ábra). Ennek az endoproteáz-családnak számos más tagja szélesebb körben expresszálódik, míg mások a neuronoktól és endokrin sejtektől eltérő, korlátozott helyeken expresszálódnak. Például a furin gyakorlatilag minden sejtben megtalálható, és elsősorban a transz-Golgi hálózatban lokalizálódik; a furin katalizálja a peptidfunkció szempontjából fontos hasításokat, például az ELH, az idegnövekedési faktor és a parathormon prekurzorok kezdeti hasítását, valamint az inzulinreceptor prekurzoron belüli hasítást a receptor aktív αβ dimer formájának előállítása érdekében. A furin néhány más feldolgozó enzim, például a PC2 és a CPE aktiválásában is szerepet játszhat.

A PC1 és a PC2 a peptidprekurzorok kiválasztott bázikus aminosavpárjainál hasít: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys és Arg-Lys. A PC1 katalizálhatja a hasítást egyes prekurzorokban, például a prosomatosztatinban és a prokolecisztokininben jelen lévő kiválasztott egyetlen Arg-helyeken is. Az LDCV-kben a PC-k által végzett hasítások szigorúan szabályozottak, gyakran nagyon rendezett módon történnek (18-6. ábra). A POMC kezdeti hasadása kevesebb mint 1 óra alatt történik (18-6. ábra, 1. és 2. lépés), míg más hasadások csak több óra múlva következnek be (18-6. ábra, 6. és 7. lépés). A propeptidek endoproteolitikus hasadása gyakran a peptid bioszintetikus feldolgozásának sebességkorlátozó reakciója.

A PC1, PC2 és furin által katalizált hasítások mintázata neuronokban és endokrin sejtekben kifejezve sokkal szelektívebb, mint a tisztított enzimekkel végzett kémcsöves vizsgálatokban megfigyelt hasítási mintázat. Például, bár a prohormon-konvertázok általában a modell peptidszubsztrátokban lévő bázikus maradékpárok COOH-terminálisánál hasítanak, a sejtekben a hasítások a bázikus maradékpárok közepén is lehetnek, mint a POMC hasítása esetén (18-6. ábra), ahol a bázikus maradékok elválnak és a két eredő érett peptiddel együtt maradnak . Valószínű, hogy az LDCV-k Ca2+ koncentrációja és belső pH-ja két olyan változó, amelyet a neuronok és az endokrin sejtek az LDCV-k endoproteolitikus aktivitásának szabályozására használnak.

A neuropeptid bioszintézisben további endoproteázok is szerepet játszhatnak. A vezető jelöltek az élesztő aszpartil-proteáz-3 (YAP-3) emlős homológja és az N-arginin-dibázikus (NRD) konvertáz . A peptid-bioszintézis egy további csavarja a szívben látható, ahol a proatriális natriuretikus faktor (proANF) az LDCV-kben tárolódik, és az érett ANF mégis a pitvari sejtekből kerül a keringésbe. A proANF feldolgozásában, amely a proANF egyetlen Arg-maradványa utáni hasítással jár, nem vehet részt a PC1 vagy PC2, mivel e PC-k elhanyagolható mennyiségben vannak jelen a szívben.

A CPE egy oldható fehérje, amely gyakorlatilag minden LDCV-ben megtalálható az idegsejtekben és az endokrin sejtekben (18-5. ábra) . Eltávolítja a bázikus maradékokat, Lys vagy Arg, a prohormon-konvertázok által termelt peptid intermedierek COOH terminusairól. Eredetileg szöveti eloszlása és szubsztrátspecifikussága, valamint guanidinoetil-merkaptoszukcininsavval (GEMSA) történő specifikus gátlása alapján azonosították. A CPE egy Co2+- és Zn2+-aktivált enzim rövid prorégióval, amelyet az enzim érése során általában eltávolítanak; a prohormon-konvertázokkal ellentétben a CPE a prorégióval együtt is aktív. A peptidfeldolgozás karboxi-peptidáz funkciója általában nem sebességkorlátozó, mivel a COOH-terminális bázikus maradékokat tartalmazó peptid intermedierek csak rendkívül alacsony koncentrációban mutathatók ki a szövet- vagy LDCV-kivonatokban. A közelmúltban további karboxipeptidázokat azonosítottak, nevezetesen a CPD-t, az enzim 3 karboxipeptidáz doménnel rendelkező integrális membránformáját. A CPE és e további karboxipeptidázok relatív jelentősége a neuropeptidek in vivo feldolgozásában nem világos. Tekintettel arra, hogy a bázikus maradékpáron történő hasítás a pár közepén lehet, jó okunk van feltételezni, hogy egy aminopeptidáz megtalálható az LDCV-kben.

A PAM egy bifunkcionális enzim, amely szinte minden LDCV-ben megtalálható (18-5. ábra) . A PAM endoproteolitikus hasítás és exopeptidáz hatás után, amikor egy COOH-terminális Gly-maradék exponálódik, peptid-szubsztrátokra hat, és a peptidil-Gly-t a megfelelő peptid-NH2-vé alakítja át. Az ismert bioaktív peptidek mintegy fele α-amidált, és az α-amidálás általában döntő fontosságú a biológiai hatékonyság szempontjából. A peptidil-Gly és a peptid-COOH formák fiziológiás koncentrációban általában inaktívak. Az α-amidálási reakció első lépését a peptidil-glicin α-hidroxiláló mono-oxigenáz (PHM) végzi, amely a bifunkcionális PAM fehérje NH2-terminális része. A PHM két Cu2+ atomot köt, amelyek redukciós és oxidációs ciklusokon keresztül vesznek részt a katalízisben. A PHM aszkorbinsavat használ redukálószerként, a hidroxilálási lépés során az O2-ből egy oxigénatom beépül a peptidbe. Így a PHM enzimatikusan nagyon hasonlít a dopamin β-mono-oxigenázhoz (DBM), amely a dopamint noradrenalinná alakítja (lásd a 12. fejezetet). Az α-amidálási reakció második lépését a PAM második enzimdoménje, a peptidil–α-hidroxiglicin α-amidáló liáz (PAL) végzi. A PAL-domén egy új, kétértékű fémion-függő enzimet alkot. A neuronok elsősorban a bifunkcionális PAM fehérje integrálmembrán formáját expresszálják (18-5. ábra), míg egy további mRNS-splicing esemény lehetővé teszi, hogy egyes endokrin sejtek a fehérje oldható, a transzmembrán domén nélküli változatát expresszálják. A PAM integrálmembrán formáiban a rövid COOH-terminális domén a citoplazmába nyúlik, és részt vesz a PAM útvonalvezetésében az LDCV-k és a sejtfelszín között. Az LDCV-k redukált aszkorbát-ellátását a citokróm B561 tartja fenn, amely fehérje öt transzmembrán doménnel rendelkezik, és az elektronokat a citoszolikus aszkorbátról az LDCV-k lumenében lévő aszkorbátra szállítja. A citokróm B561 a katecholamin-tartalmú vezikulákban is megtalálható, ahol hasonló funkciót lát el a DBM számára (lásd a 12. fejezetet). Az ideg- és endokrin szövetek a redukált aszkorbát koncentrációját a vér aszkorbátkoncentrációja felett mintegy 100-szorosan tartják fenn, míg a legtöbb más szövet nem koncentrálja az aszkorbátot.

Néhány peptidnek van NH2-terminális piroglutaminsav-maradványa, más néven ciklikus glutaminsav (<Glu), amely a bioaktivitás szempontjából lényeges, például a tirotropin-releasing hormon (TRH) és a gonadotropin-releasing hormon (GnRH). Az ezért a lépésért felelős enzim a glutaminil-cikláz, amely az eredeti NH2-terminális Gln-t <Glu-vá alakítja. A glutaminil-cikláz szabályozását és működését még nem vizsgálták alaposan. A peptidek másik fontos, de ritkán előforduló módosítása az α-N-acetilezés (18-6. és 18-7. ábra). A POMC-feldolgozás során az α-N-acetilezés nagymértékben növeli az ACTH(1-13)NH2 bőrsötétítő hatását, miközben megszünteti mind az ACTH mellékvese szteroidogén hatását, mind a β-endorfin ópiát-aktivitását. Az ezért a módosításért felelős enzim(ek)et még nem sikerült tisztítani vagy klónozni.

A 18-6. ábra példaként a POMC rendszerben a feldolgozási lépések mintázatát mutatja . A kezdeti endoproteolitikus lépéseket (18-6. ábra, 1-4. lépések) a PC1 közvetíti, és minden POMC-termelő neuronban és endokrin sejtben előfordulnak, általában az ábrán látható számsorrendben. Egyértelmű, hogy az 1. és 2. lépés a transz-Golgi-hálózatban indul és az LDCV-kben folytatódik, míg a 4. lépés csak az LDCV-kben történik. Az 5-7. lépések csak az LDCV-kben fordulnak elő, és úgy tűnik, hogy a PC2-t igénylik. A felnőtt elülső agyalapi mirigyben a kortikotropok PC1-et tartalmaznak, de PC2-t nem, és csak az 1-4. hasítási lépéseket hajtják végre. A korai posztnatális fejlődés során azonban a kortikotropok PC2-t is expresszálnak, és az 5-7. hasítási lépések átmenetileg megjelennek a kortikotropokban. Patkányban a PC2 expressziója és az ACTH-n belüli hasítás (5. hasítás) egyszerre csökken néhány héttel a születés után, körülbelül akkor, amikor megjelenik a mellékvese szteroidogenezis ACTH általi kontrolljának felnőttkori mintázata.

A POMC-t termelő melanotropok és CNS-neuronok mind a PC1-et, mind a PC2-t expresszálják, és így a kisebb peptidtermékek is megjelennek ezekben a sejtekben. A PAM minden POMC-termelő sejtben expresszálódik, így a csatlakozó peptid (JP), egy kis peptid, amelynek nincs egyértelmű biológiai funkciója, α-amidációja minden POMC-sejtben gyorsan bekövetkezik (18-6. ábra). Az intermedier hipofízis melanotrop sejtjeiben és a szoliter traktus magjának POMC-neuronjaiban az ACTH(1-13)NH2 és a β-endorfin α-N-acetilációja történik. A melanotropokban az ACTH α-N-acetilációja már az 5. hasadás előtt bekövetkezhet. Amint a 18-4. ábrán látható, az elvégzett konkrét hasítások és a peptidtermékek NH2- és COOH-terminálisain végzett módosítások határozzák meg a felszabaduló bioaktív peptidek keverékét.