Van ‘t Hoff legkorábbi hírnevét a szerves kémia területén szerezte. 1874-ben úgy magyarázta az optikai aktivitás jelenségét, hogy feltételezte, hogy a szénatomok és szomszédaik közötti kémiai kötések egy szabályos tetraéder sarkai felé irányulnak. Ez a háromdimenziós szerkezet magyarázta a természetben előforduló izomereket. Ezt az érdemet megosztja Joseph Le Bel francia vegyésszel, aki ettől függetlenül ugyanerre az ötletre jutott.
Három hónappal a doktori cím megszerzése előtt Van ‘t Hoff közzétette ezt az elméletet, amelyet ma a sztereokémia alapjának tekintenek, először egy holland röpiratban 1874 őszén, majd a következő év májusában egy kis francia könyvben La chimie dans l’espace címmel. A német fordítás 1877-ben jelent meg, abban az időben, amikor Van ‘t Hoff egyetlen állást talált az utrechti állatorvosi iskolában. Ezekben a korai években elméletét a tudományos közösség nagyrészt figyelmen kívül hagyta, és az egyik kiemelkedő kémikus, Hermann Kolbe élesen bírálta. Kolbe azt írta:
“Egy Dr. J. H. van ‘t Hoff az utrechti állatorvosi iskolából, úgy tűnik, nem kedveli a pontos kémiai vizsgálatokat. Kényelmesebbnek tartotta, hogy felszálljon a Pegazusra (nyilvánvalóan az állatorvosi iskolától kölcsönzött) és a ‘La chimie dans l’espace’ című művében hirdesse, hogy a kémiai Parnasszus csúcsára való merész repülése során az atomok a kozmikus térben való elrendeződését látta.”
1880 körül azonban Van ‘t Hoff elméletének támogatása olyan jelentős kémikusok részéről, mint Johannes Wislicenus és Viktor Meyer, elismerést hozott.
1884-ben Van ‘t Hoff Études de Dynamique chimique (“Tanulmányok a kémiai dinamikáról”) címmel publikálta a kémiai kinetikával kapcsolatos kutatásait, amelyben egy új módszert írt le a reakció sorrendjének meghatározására grafikonok segítségével, és a termodinamika törvényeit alkalmazta a kémiai egyensúlyokra. Bevezette a kémiai affinitás modern fogalmát is. 1886-ban kimutatta a híg oldatok és a gázok viselkedése közötti hasonlóságot. 1887-ben Wilhelm Ostwald német vegyésszel együtt megalapította a Zeitschrift für physikalische Chemie (“Fizikai kémiai folyóirat”) című befolyásos tudományos folyóiratot. Dolgozott Svante Arrheniusnak az elektrolitok disszociációjára vonatkozó elméletén, és 1889-ben megadta az Arrhenius-egyenlet fizikai igazolását. 1896-ban a berlini Porosz Tudományos Akadémia professzora lett. A stassfurti sólerakódásokkal kapcsolatos tanulmányai fontos hozzájárulást jelentettek a porosz vegyiparhoz.
Van ‘t Hoff az utrechti állatorvosi főiskola kémia és fizika tanára lett. Ezután közel 18 évig az Amszterdami Egyetemen a kémia, ásványtan és geológia professzoraként dolgozott, mielőtt végül a kémiai tanszék elnöke lett. 1896-ban Van ‘t Hoff Németországba költözött, ahol 1911-ben a berlini egyetemen fejezte be pályafutását. 1901-ben megkapta az első kémiai Nobel-díjat az oldatokkal kapcsolatos munkásságáért. Munkájával kimutatta, hogy a nagyon híg oldatok olyan matematikai törvényszerűségeket követnek, amelyek nagyon hasonlítanak a gázok viselkedését leíró törvényekhez.