Abstract
A difenhidramin (DPH) egy gyakori, vény nélkül kapható antihisztamin, amely álmosságot okoz és potenciálisan kábítószer hatása alatt vezethet…okozhat baleseteket. A mai napig nem áll rendelkezésre kereskedelmi forgalomban immunpróba-szűrő készlet a biológiai folyadékokban, például vizeletben és/vagy vérben történő kimutatására. Leírunk egy újonnan kifejlesztett, enzimhez kötött immunoszorbens assay (ELISA) szűrővizsgálatot, és beszámolunk annak hasznosságáról önkéntesektől vett hiteles minták elemzése során. A teszt specifikus a DPH kimutatására, és nem mutat ki olyan közeli rokon antihisztaminokat, mint a bromfeniramin, a klórfeniramin és a doxilamin. Változó mértékű keresztreaktivitás figyelhető meg bizonyos triciklikus vegyületekkel, a DPH és a DPH oldalláncszerkezetének hasonlósága miatt. A vizsgálat napon belüli és napon belüli pontosságát 10%-nál kisebbnek határozták meg. Az analízis rendkívül érzékeny, munkatartománya vizelet esetében 1 és 500 ng/ml, vér esetében pedig 1 és 250 ng/ml között van. Az assay további validálása önkéntesektől és halottkémi laboratóriumokból származó hiteles vizelet- és vérmintákkal történt.
Bevezetés
A difenhidramin (DPH), a 2-difenilmetoxi-N,N-dimetil-etanamin egy etanolamin alapú antihisztamin. Ez volt az egyik első antihisztamin hatóanyag, amelyet 1946-ban fedeztek fel, és széles körben alkalmazzák a gyakori allergiás tünetek enyhítésére. A DPH úgy fejti ki hatását, hogy blokkolja a hisztamin hatását a H1-receptoroknál, továbbá CYP2D6-gátló és központi idegrendszeri (CNS) depresszáns. Amellett, hogy antihisztamin, hányáscsillapítóként, köhögéscsillapítóként és nyugtatóként is alkalmazzák. Bár hatékony, a DPH-nak számos mellékhatása van, amelyek közé tartozik az álmosság, a motoros károsodás, a szapora szívverés, a homályos látás és mások (1, 2), ezért veszélyes vezetési helyzetekben kockázati tényezőként számoltak be róla (3-5). A DPH más gyógyszerekkel és/vagy alkohollal való kölcsönhatásai tovább növelhetik a vezetéssel kapcsolatos balesetek és halálesetek kockázatát.
Az antihisztaminokat nagyjából első generációs, második generációs és vényköteles antihisztaminokra osztják. Az első generációs antihisztaminok, amelyek közé tartozik a DPH (Benadryl™), mind recept nélkül kaphatók és kifejezett álmosságot okoznak. Az ebbe az osztályba tartozó rokon antihisztaminok a klórfeniramin (Singlet™), a bromfeniramin (Dimetapp™) és a doxilamin (Vicks NyQuil™). Egy másik első generációs antihisztamin a DPH 8-klórteofillinát sója, az úgynevezett dimenhidrinát (Dramamine™), amelyet utazási betegségre írnak fel. A második generációs antihisztaminok közé tartozik a loratadin (Claritin™), a deszloratadin (Clarinex™), az akrivastin (Semprex-D™), az ebastin (Kestine™), a cetirizin (Zyrtec™) és a fexofenadin (Allegra™), amelyek a DPH nem álmosító alternatívái. Az 1. ábra a gyakran előforduló antihisztaminok kémiai szerkezetét mutatja.
Az antihisztaminok kémiai szerkezete.
Az antihisztaminok kémiai szerkezete.
A DPH altató hatása miatt más gyógyszerekkel, például paracetamollal kombinálták, olyan készítményekben, mint a Tylenol PM™, vagy olyan orrcseppekkel, mint a pszeudoefedrin. Bár a DPH az egyik legrégebbi antihisztamin, könnyen kapható recept nélkül, és hatékonyabb és gyorsabb hatású, mint a legújabb vényköteles gyógyszerek némelyike, ezért széles körben elterjedt a használata (6). A Benadryl figyelmeztető címkéje egyértelműen jelzi a gyógyszer szedése utáni vezetés veszélyét. Továbbá számos tanulmány egyértelműen bizonyította a motoros készségek és a kognitív teljesítmény károsodását a gépjárművek kezelésének összetett feladatával kapcsolatban a DPH szedése után, szemben egy második generációs antihisztaminnal vagy akár alkohollal (7-12). Tanulmány készült a DPH szedését követő megnövekedett sérülésveszélyről is a második generációs antihisztaminokhoz képest (13). Ezek a vizsgálatok egyértelműen indokolttá tennék az elsődlegesen DPH-ra vonatkozó vizsgálatok fontosságát.
A DPH többféle adagolási formában kapható, beleértve a folyadékot, tablettákat, kapszulákat, rágógumikat és helyi krémeket. A felnőttek számára javasolt adagolás 4-6 óránként 25-50 mg között van, amely nem haladhatja meg az 50-100 mg-ot (1). A DPH bevételekor gyorsan felszívódik a szervezetben, a maximális aktivitás körülbelül 1 órával a gyógyszer bevétele után észlelhető. A DPH felezési ideje körülbelül 2-9 óra, a maximális plazmakoncentráció az adag bevétele után körülbelül 1-4 óra elteltével érhető el. Egyszeri 50 mg-os orális adagot követően 3 óra elteltével 83 ng/ml átlagos csúcs plazmakoncentrációjú difenhidramint mutattak ki, amely aztán 24 órára 9 ng/ml-re csökkent (14). A DPH egyszeri orális 100 mg-os adagja 112 ng/ml átlagos csúcsplazmakoncentrációt eredményezett 2 órával az adagolás után (15). Az antihisztaminok hatékonysága 25 ng/ml-nél nagyobb koncentrációknál jelentkezik, 30-40 ng/ml-nél álmosság, 60 ng/ml feletti koncentrációknál pedig szellemi károsodás figyelhető meg (16). Jelentések szerint a DPH terápiás szintje a vérben 25 és 112 ng/ml között van, a toxikus szint 5000 ng/ml körül van, a halálos szint pedig 8000 ng/ml felett van (3, 17). A DPH-val való visszaélés számos esetét is dokumentálták már évek óta (18-20).
A DPH in vivo metabolizmusa azt eredményezi, hogy a dózis körülbelül 30%-a az N-deszmetil-metabolitba alakul át, ezt követi az N,N-dideszmetil-metabolit képződése, és a dózis 13%-a az aminon keresztül acetil-metabolitokká alakul át. Egy kis százalék difenil-metoxi-ecetsavvá alakul át, és a dózis fennmaradó nagy százaléka változatlanul, mint az alapanyag kiválasztódik (21, 22). A difenhidramin metabolizmusát a 2. ábra vázolja fel.
A difenhidramin metabolizmusa in vivo.
A difenhidramin metabolizmusa in vivo.
A DPH emberi plazmában történő vizsgálatának hagyományos módszerei drága és időigényes mintaextrakciót, majd megerősítő eljárásokat igényeltek. Számos csoport számolt be különböző gázkromatográfiás (GC) módszerek alkalmazásáról a DPH plazmában és vizeletben történő kimutatására (23-27). A DPH kimutatására kifejlesztett kapilláris elektroforézis (28) és folyadékkromatográfiás-tömegspektrometriai (LC-MS) módszerekről is beszámoltak (29). A szakirodalomban eddig nem jelentek meg beszámolók a difenhidramin ELISA vagy más immunpróba-módszerrel történő szűréséről. Ebben a közleményben az első ELISA-szűrési módszerről számolunk be a DPH emberi vizeletben és vérben történő kimutatására.
A toxikológiai laboratóriumokban bevett gyakorlatnak számít az immunpróbás szűrés elvégzése, amelynek során a pozitív mintákat először azonosítják, majd GC-MS vagy LC-MS technikákkal tovább erősítik. Ezt a legtöbb toxikológiai laboratórium “költség-haszon” stratégiaként alkalmazza, szemben a drágább megerősítő eljárás elvégzésével minden beérkező mintán. Ezért hasznos lenne egy megbízható ELISA-szűrési módszer, amelyet a közlekedési balesetekkel és halálos kimenetelű balesetekkel kapcsolatos DPH-mintákra lehetne alkalmazni. E cél érdekében a toxikológusok ajánlásokat fogalmaztak meg a DUID-re vonatkozóan, beleértve a vérben javasolt 25 ng/ml és a vizeletben javasolt 50 ng/ml DPH határértéket (30). Ez a cikk egy robusztus és pontos ELISA-szűrési módszert ír le a DPH kimutatására emberi vizeletben és vérben, amely ezeket a javasolt irányelveket követi.
Kísérleti
Anyagok
Reagensek és vegyi anyagok. A difenhidramin a Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), a difenhidramin-d3 (100 μg/mL oldat metanolban) pedig a Cerilliant (Round Rock, TX) cégtől származott. A DPH-specifikus poliklonális antitestet az Immunalysis (Pomona, CA) tenyésztette, a DPH-hapteneket és a torma-peroxidázzal jelölt konjugátumokat pedig az Immunalysisnél szintetizálták. A kolorimetriás reakcióhoz használt 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) szubsztrátreagens a Pierce-től (Rockford, IL) származik. A felhasznált enzimek a következők voltak: a Sigma-Aldrich-tól (Milwaukee, WI) kapott szarvasmarha-tiroglobulin (BTG), a BBI Enzymes-től (Madison, WI) kapott torma-peroxidáz (HRP) és a Proliant Biologicals-tól (Boone, IA) kapott szarvasmarha-szérumalbumin (BSA). Minden felhasznált oldószer HPLC minőségű volt, és minden vegyszer ACS minőségű volt, és a Spectrum Chemicals-tól (Gardena, CA) származott. Az ELISA-hoz a DPH 1000 ng/mL-es magas kalibrátorait szintetikus negatív vizeletben és szintetikus negatív vérben állítottuk elő, és 4°C-on tároltuk. Az ebben a vizsgálatban használt szintetikus negatív vizeletet és szintetikus negatív vért az adott mátrixokban található összetevőkből állították össze, és megfeleltek három negatív humán vizelet- és vérminta immunvizsgálati reakcióinak (31, 32). A szintetikus negatív vizelet 0,1%-os BSA oldatból áll deionizált vízben; 0,2% FD&C sárga #6 festékkel, a szintetikus negatív vér pedig az Immunalysis saját készítményéből áll.
Készülék. Az immunglobulin G (IgG) tisztítására használt HiTrap protein G HP affinitás oszlopokat a GE Healthcare-től (Pittsburgh, PA) vásárolták. A standard polisztirol mikrotiterlemezeket (96 lyuk) a Corning Costartól (Corning, NY) szereztük be. A Tecan Columbus Pro mikrotiterlemezmosót és a Tecan Sunrise lemezolvasót a Tecan-tól (San Jose, CA) szereztük be. Az immunpróba-fejlesztési folyamat során használt pipettákat a Rainin Instruments (Oakland, CA) cégtől szereztük be. Az LC-MS-MS elemzéshez használt 6410 triple-quadrupole MS-t és a Zorbax Eclipse XDB C18 oszlopot egyaránt az Agilent Technologies-tól (Santa Clara, CA) vásároltuk.
Módszerek
ELISA. Az ELISA-módszer kifejlesztésének elsődleges lépése poliklonális antitestek előállítása volt, amelyek egy kiválasztott állatfaj DPH-specifikus antigénre adott immunkémiai válaszán alapultak. E cél érdekében először nyulakat immunizáltak egy DPH-antigénnel, amely szarvasmarha-tiroglobulinhoz (BTG) konjugált DPH-ból állt. A nyulak immunizálásának és kivéreztetésének folyamatát egy erre szakosodott állattartó létesítményben végezték. A nyulakból nyert szérumot házon belül tisztították meg affinitáskromatográfiával, protein G oszlopokon keresztül történő elúcióval, a tisztított IgG-frakció kinyerése érdekében. A DPH-specifikus poliklonális IgG-t ezután 96 lyukú polisztirol mikrotiterlemezeken immobilizálták. A felesleges antitestet leszívtuk, a szabad antitest-kötőhelyeket 1%-os trehalózoldattal vízben blokkoltuk, majd a lemezeket vákuumkemencében 37°C-on egy éjszakán át szárítottuk. A lemezeket a továbbiakban nedvszívószerrel lezárt tasakban tároltuk, mivel kritikus fontosságú, hogy nedvességtől mentesen tartsuk őket. A DPH vizelet dózis-válasz görbét először úgy készítettük el, hogy a negatív szintetikus vizeletet 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 és 500 ng/ml koncentrációban erősítettük a hatóanyag magas kalibráló törzsoldatából. A vérgörbét negatív szintetikus vér 1, 5, 10, 25, 50, 100 és 250 ng/ml koncentrációban történő dúsításával állítottuk elő a magas kalibráló oldatból. Ezeket a szintetikus vérben lévő kalibrátorokat az elemzés előtt tovább hígítottuk 1:10 arányban 100 mM foszfátpufferrel, amely 150 mM nátrium-kloridot tartalmazott (foszfátpufferelt sóoldat, pH 7,0). Az összes vérmintát hasonlóképpen 1:10 arányban hígítottuk foszfátpufferes sóoldattal (pH 7,0). A vizeletmintákat szintén 1:20 arányban hígítottuk 100 mM foszfátpufferes sóoldattal (pH 7,0). A kalibrátorokat és a mintákat ezután két példányban pipettáztuk a mikrotiterlemez mélyedéseibe, mind a vizelet, mind a vér esetében 10 μl mintát használva. Ezt követte 100 μL HRP-vel jelölt difenhidraminból álló enzimkonjugátum hozzáadása. Ezután a lemezt 1 órán át hagytuk inkubálni sötétben, szobahőmérsékleten. Ezután a lyukakat hatszor 350 μL ionmentesített vízzel mostuk át mikrotiterlemezmosó segítségével, a víz eltávolítása érdekében leszívtuk, majd megfordítottuk és szárazra csaptuk, hogy eltávolítsuk a maradék vizet a lyukakból. Ezután a kromogén TMB-szubsztrátot (100 μL) adtuk minden egyes lyukba, majd a lemezt további 30 percig inkubáltuk sötétben. A reakciót ezután 100 μL 1 N sósavval állítottuk le, hogy sárga színt kapjunk. A vizsgálat kolorimetrikus, és az abszorbanciát 450 nm és 650 nm kettős hullámhosszon olvastuk le mikrotiterlemez-olvasóval. A 650 nm-es hullámhosszon a háttérabszorbanciát mérjük, amelyet a lemezolvasó aztán levon a végső abszorbanciából. A keletkező szín intenzitása fordítottan arányos a mintában lévő analit koncentrációjával.
LC-MS-MS. Az elemzéshez egy 1200-as sorozatú LC-pumpát használtunk, amelyhez egy pozitív elektrospray-ionizációs (ESI) üzemmódban működő 6410-es háromszoros kvadrupolos MS-t kapcsoltunk. Az alkalmazott LC-MS-MS oszlop egy Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm) volt. Az elemzésre szánt mintát a következőképpen készítettük el: egy 100 µl vizeletmintát, amely 50 µl difenhidramin-d3-t (200 ng/mL) tartalmazott, egy autosampler fiolába adtunk. A mintákat egy autoinjektoron keresztül közvetlenül az LC-MS-MS-be fecskendeztük. Az oszlop hőmérsékletét 60 °C-on tartottuk, az injekciós térfogat pedig 5 µl volt. A mozgófázis 0,2%-os ecetsav pH 4 (A oldószer) és metanol (B oldószer) volt. Kezdetben a mobilfázis összetétele 100% A volt 0,7 ml/perc áramlási sebességgel 6 percig, majd a metanol százalékos arányát 100%-ra növelték, majd 7 perc után ismét 100% A-ra állították vissza.
A gáz hőmérséklete 350°C volt, a gázáram 10 L/perc volt, a porlasztó nyomását 50 psi-en tartották. Ütközőgázként nitrogént használtunk, a kapilláris feszültsége pedig 4000 V volt. Minden hatóanyaghoz két átmenetet választottunk ki és optimalizáltunk. A tartózkodási idő 50 ms volt, és az optimális fragmentáló energia 80 V volt minden átmenet esetében. Az optimális ütközési energiafeszültséget 35V-nak határoztuk meg a deuterált belső standardhoz (difenhidramin-d3), 15V-nak az elsődleges átmenethez és 30V-nak a másodlagos átmenethez magához a difenhidraminhoz. A minősítő átmenet és a mennyiségi átmenet arányát körülbelül a kalibrációs tartomány közepén határoztuk meg: 100 ng/ml. A difenhidramin-d3 átmenet 259,7 > 165,2; a difenhidramin elsődleges (számszerűsítő) átmenete 256,7 > 167,2; a minősítő (másodlagos) átmenet 256,7 > 152,2 volt. A nem jelölt difenhidramin az alkalmazott ütközési energiától függően a prekurzorionból 167 vagy 165 m/z-es termékionokra bomolhat. Eljárásunkat a leírt feltételek mellett validáltuk. Az LC-MS-MS módszer kimutatási határa (LOD) 10 ng/ml volt, és a > 2 jel/zaj aránnyal kimutatható legkisebb koncentrációnak határoztuk meg.
Eredmények és megbeszélés
Dózis-válaszgörbe
A módszer az enzimkonjugátum és a mintában lévő szabad analit közötti kompetitív kötődést használja az antitest-kötőhelyek rögzített mennyiségéért, amely arányos a keverékben lévő koncentrációjukkal. A DPH dózis-válasz görbéket szintetikus negatív vizeletben és szintetikus negatív vérben készítettük a korábban leírt koncentrációkkal. B0 a negatív kalibrátor abszorbanciája, B pedig az egyes kalibrátorszintek abszorbanciáját jelenti. Az egyedi kalibrátor és a negatív kalibrátor százalékos arányát (B/B0) minden kalibrátorszintre kiszámítottuk, és a hatóanyag-koncentráció (ng/ml) függvényében ábrázoltuk mind a vizelet, mind a vér esetében (3. ábra). A B/B0 értékek fordítottan arányosak a mintában lévő gyógyszer koncentrációjával, aminek az az oka, hogy minél magasabb a gyógyszer koncentrációja, annál kevesebb gyógyszer-enzim konjugátum kötődik az antitesthez, ezáltal alacsonyabb abszorbanciaértéket eredményezve.
Difenhidramin dózis-válasz görbéje a vizeletben és a vérben.
Difenhidramin dózis-válasz görbéje a vizeletben és a vérben.
LOD és cutoff
A DPH-teszt LOD-ját úgy határoztuk meg, mint a legalacsonyabb koncentrációt, amely a teszt leírt paraméterei alapján pontosan mérhető. Három gyógyszermentes autentikus vizeletmintát különböző DPH-koncentrációkkal dúsítottunk 1 ng/ml-ig, majd két példányban elemeztük. A két standard eltérésből számított legalacsonyabb értéket kaptuk, és ezen eredmény alapján a vizsgálat LOD értékét 1 ng/ml-ben határoztuk meg. A határkoncentrációt vizelet esetében 50 ng/ml-re, vér esetében pedig 25 ng/ml-re tervezték. Mindkettőt optimális döntési pontként határoztuk meg a kalibrátorok két standard eltérése alapján a dózis-válasz görbe lineáris részén, valamint a toxikológiai szakterület által megállapított ajánlott irányelveket szem előtt tartva.
Szelektivitás
A rokon és nem rokon vegyületek interferenciáját úgy vizsgáltuk, hogy ezeket az anyagokat szintetikus negatív vizeletbe spicceltük és az ELISA-tesztben futtattuk. Az I. táblázat mutatja a keresztreaktivitási adatokat a difenhidraminhoz szerkezetében és farmakológiai aktivitásában szorosan kapcsolódó vegyületekkel, amelyek a vizsgálat 50 ng/ml-es határértékénél 1%-os vagy az alatti értéket mutattak. Az orfenadrin, amely izomrelaxáns és antihisztamin hatású szer is, 42%-os keresztreakciót mutatott a teszttel, mivel szerkezete nagyon hasonló a DPH-hoz, bár egy metil szubsztituenscsoporttal rendelkezik. A 2. ábrán látható DPH-metabolitok egyikét sem vizsgálták keresztreaktánsként ebben a vizsgálatban, mivel akkoriban nem voltak kereskedelmi forgalomban kaphatók.
Keresztreaktivitás szerkezetileg és farmakológiailag rokon vegyületekkel
| Drog . | Koncentráció (ng/ml) . | % keresztreaktivitás . |
|---|---|---|
| Bromfeniramin | 500 | 0,82 |
| Klórfeniramin | 500 | 0.50 |
| Doxilamin | 1000 | 0.49 |
| Orfenadrin | 1000 | 42.00 |
| Drog . | Koncentráció (ng/ml) . | % keresztreaktivitás . |
|---|---|---|
| Bromfeniramin | 500 | 0.82 |
| Klórfeniramin | 500 | 0.50 |
| Doxilamin | 1000 | 0.49 |
| Orfenadrin | 1000 | 42.00 |
Keresztreaktivitás szerkezetileg és farmakológiailag rokon vegyületekkel
| Drog . | Koncentráció (ng/ml) . | % keresztreaktivitás . |
|---|---|---|
| Bromfeniramin | 500 | 0,82 |
| Klórfeniramin | 500 | 0.50 |
| Doxilamin | 1000 | 0.49 |
| Orfenadrin | 1000 | 42.00 |
| Drog . | Koncentráció (ng/ml) . | % keresztreaktivitás . |
|---|---|---|
| Bromfeniramin | 500 | 0.82 |
| Klórfeniramin | 500 | 0.50 |
| Doxilamin | 1000 | 0.49 |
| Orfenadrin | 1000 | 42.00 |
A DPH-val nem rokon vegyületeket szintén 100 000 ng/ml koncentrációban elemezték a vizsgálatban. A II. táblázat mutatja a keresztreaktivitást ezekkel a nem rokon vegyületekkel. E vegyületek többsége nem zavarta a DPH kimutatását az analízisben. Az oldalláncszerkezet hasonlósága miatt több vegyület, mint például az amitriptilin, a klórpromazin, a klomipramin, a doxepin, az imipramin és a ciklobenzaprin különböző mértékű keresztreaktivitást mutatott az analízissel. A megerősítő módszerek lehetőleg kizárnák az ELISA által észlelt hamis pozitív eredményeket, amelyek az említett keresztreagáló szerekből adódnak, és amelyek zavarhatják a DPH-tesztet. A DPH-mentes autentikus vizelet- és vérmintákból származó mátrixhatásokat is megvizsgálták, hogy meghatározzák a vizsgálatra gyakorolt hatásukat. A vizelet- és vérmátrixok okozta nemkívánatos hamis pozitív eredményeket nem figyeltek meg, amikor LC-MS-MS-vel megerősített DPH-mentes vizelet- és vérmintákat vizsgáltak a teszttel.
Keresztreaktivitás nem rokon vegyületekkel
| Drog . | Koncentráció (ng/ml) . | % keresztreaktivitás . |
|---|---|---|
| Amitriptilin | 500 | 0,82 |
| Klórpromazin | 500 | 0.50 |
| Klomipramin | 1000 | 0.49 |
| Ciklobenzaprin | 100 | 250.00 |
| Doxepin | 100 | 47.10 |
| Imipramin | 250 | 11.80 |
| Norclomipramin | 2000 | 0.57 |
| Nordoxepin | 4000 | 0.19 |
| Protriptilin | 500 | 0.52 |
| Trimipramin | 500 | 4.08 |
| Dezipramin | 20,000 | 0.10 |
| Benzilpiperazin | 100,000 | ND* |
| Karbamazepin | 100,000 | ND |
| Kokain | 100,000 | ND |
| Kodein | 100,000 | ND |
| Dextrometorfán | 100,000 | ND |
| Diazepám | 100,000 | ND |
| EDDP | 100,000 | ND |
| Ephedrin | 100,000 | ND |
| Flunitrazepam | 100,000 | ND |
| Flurazepam | 100,000 | ND |
| Glutetimid | 100,000 | ND |
| Ketamin | 100,000 | ND |
| Lidokain | 100,000 | ND |
| MDMA | 100,000 | ND |
| Methadon | 100,000 | ND |
| Metamfetamin | 100,000 | ND |
| Metaqualon | 100,000 | ND |
| PCP | 100,000 | ND |
| Pentazocin | 100,000 | ND |
| Phenobarbital | 100,000 | ND |
| PMA | 100,000 | ND |
| Propoxifen | 100,000 | ND |
| 3-TFMPP | 100,000 | ND |
| Drog . | Koncentráció (ng/ml) . | % keresztreaktivitás . |
|---|---|---|
| Amitriptilin | 500 | 0,82 |
| Klórpromazin | 500 | 0.50 |
| Klomipramin | 1000 | 0.49 |
| Ciklobenzaprin | 100 | 250.00 |
| Doxepin | 100 | 47.10 |
| Imipramin | 250 | 11.80 |
| Norclomipramin | 2000 | 0.57 |
| Nordoxepin | 4000 | 0.19 |
| Protriptilin | 500 | 0.52 |
| Trimipramin | 500 | 4.08 |
| Dezipramin | 20,000 | 0.10 |
| Benzilpiperazin | 100,000 | ND* |
| Karbamazepin | 100,000 | ND |
| Kokain | 100,000 | ND |
| Kodein | 100,000 | ND |
| Dextrometorfán | 100,000 | ND |
| Diazepám | 100,000 | ND |
| EDDP | 100,000 | ND |
| Ephedrin | 100,000 | ND |
| Flunitrazepam | 100,000 | ND |
| Flurazepam | 100,000 | ND |
| Glutetimid | 100,000 | ND |
| Ketamin | 100,000 | ND |
| Lidokain | 100,000 | ND |
| MDMA | 100,000 | ND |
| Methadon | 100,000 | ND |
| Metamfetamin | 100,000 | ND |
| Metaqualon | 100,000 | ND |
| PCP | 100,000 | ND |
| Pentazocin | 100,000 | ND |
| Phenobarbital | 100,000 | ND |
| PMA | 100,000 | ND |
| Propoxifen | 100,000 | ND |
| 3-TFMPP | 100,000 | ND |
* ND = nem észlelt.
Keresztreaktivitás nem rokon vegyületekkel
| Drog . | Koncentráció (ng/ml) . | % keresztreaktivitás . |
|---|---|---|
| Amitriptilin | 500 | 0,82 |
| Klórpromazin | 500 | 0.50 |
| Klomipramin | 1000 | 0.49 |
| Ciklobenzaprin | 100 | 250.00 |
| Doxepin | 100 | 47.10 |
| Imipramin | 250 | 11.80 |
| Norclomipramin | 2000 | 0.57 |
| Nordoxepin | 4000 | 0.19 |
| Protriptilin | 500 | 0.52 |
| Trimipramin | 500 | 4.08 |
| Dezipramin | 20,000 | 0.10 |
| Benzilpiperazin | 100,000 | ND* |
| Karbamazepin | 100,000 | ND |
| Kokain | 100,000 | ND |
| Kodein | 100,000 | ND |
| Dextrometorfán | 100,000 | ND |
| Diazepám | 100,000 | ND |
| EDDP | 100,000 | ND |
| Ephedrin | 100,000 | ND |
| Flunitrazepam | 100,000 | ND |
| Flurazepam | 100,000 | ND |
| Glutetimid | 100,000 | ND |
| Ketamin | 100,000 | ND |
| Lidokain | 100,000 | ND |
| MDMA | 100,000 | ND |
| Methadon | 100,000 | ND |
| Metamfetamin | 100,000 | ND |
| Metaqualon | 100,000 | ND |
| PCP | 100,000 | ND |
| Pentazocin | 100,000 | ND |
| Phenobarbital | 100,000 | ND |
| PMA | 100,000 | ND |
| Propoxifen | 100,000 | ND |
| 3-TFMPP | 100,000 | ND |
| Drog . | Koncentráció (ng/ml) . | % keresztreaktivitás . |
|---|---|---|
| Amitriptilin | 500 | 0.82 |
| Klórpromazin | 500 | 0.50 |
| Klomipramin | 1000 | 0.49 |
| Ciklobenzaprin | 100 | 250.00 |
| Doxepin | 100 | 47.10 |
| Imipramin | 250 | 11.80 |
| Norclomipramin | 2000 | 0.57 |
| Nordoxepin | 4000 | 0.19 |
| Protriptilin | 500 | 0.52 |
| Trimipramin | 500 | 4.08 |
| Dezipramin | 20,000 | 0.10 |
| Benzilpiperazin | 100,000 | ND* |
| Karbamazepin | 100,000 | ND |
| Kokain | 100,000 | ND |
| Kodein | 100,000 | ND |
| Dextrometorfán | 100,000 | ND |
| Diazepám | 100,000 | ND |
| EDDP | 100,000 | ND |
| Ephedrin | 100,000 | ND |
| Flunitrazepam | 100,000 | ND |
| Flurazepam | 100,000 | ND |
| Glutetimid | 100,000 | ND |
| Ketamin | 100,000 | ND |
| Lidokain | 100,000 | ND |
| MDMA | 100,000 | ND |
| Methadon | 100,000 | ND |
| Metamfetamin | 100,000 | ND |
| Metaqualon | 100,000 | ND |
| PCP | 100,000 | ND |
| Pentazocin | 100,000 | ND |
| Phenobarbital | 100,000 | ND |
| PMA | 100,000 | ND |
| Propoxifen | 100,000 | ND |
| 3-TFMPP | 100,000 | ND |
* ND = nem észlelt.
Pontosság
Az ELISA napon belüli és napközi pontosságát csak szintetikus vizeletben végeztük 0, 5, 10, 25 és 50 ng/ml koncentrációban. A napon belüli pontosságot az ugyanazon a napon elvégzett 8 analízisből (n = 8) számított variációs együttható (CV%) alapján számították ki, és 10%-nál kisebb volt, a napközi pontosságot (CV%) pedig 10 napon keresztül napi 8 analízisből (n = 80) számították ki, és szintén 10%-nál kisebbnek találták. Az adatokat a III. táblázat tartalmazza.
ELISA napon belüli és napközi pontosság
| Koncentráció (ng/ml) . | Az absz. átlaga . | SD . | CV% . | |
|---|---|---|---|---|
| Napközi pontosság (n = 8) | ||||
| 0 | 3.30 | 0.04 | 1.06 | |
| 5 | 2.07 | 0.09 | 4.18 | |
| 10 | 1.83 | 0.04 | 2.04 | |
| 25 | 1.57 | 0.06 | 3.99 | |
| 50 | 1.40 | 0.02 | 1.46 | |
| Napközi pontosság (n = 80) | ||||
| 0 | 3.44 | 0.12 | 3.60 | |
| 5 | 2.28 | 0.20 | 8.70 | |
| 10 | 1.99 | 0.18 | 9.02 | |
| 25 | 1.67 | 0.15 | 8.74 | |
| 50 | 1.50 | 0.13 | 8.85 |
| Koncentráció (ng/ml) . | Az absz. átlaga . | SD . | CV% . | |
|---|---|---|---|---|
| Napközi pontosság (n = 8) | ||||
| 0 | 3,30 | 0 .04 | 1.06 | |
| 5 | 2.07 | 0.09 | 4.18 | |
| 10 | 1.83 | 0.04 | 2.04 | |
| 25 | 1.57 | 0.06 | 3.99 | |
| 50 | 1.40 | 0.02 | 1.46 | |
| Napközi pontosság (n = 80) | ||||
| 0 | 3.44 | 0.12 | 3.60 | |
| 5 | 2.28 | 0.20 | 8.70 | |
| 10 | 1.99 | 0.18 | 9.02 | |
| 25 | 1.67 | 0.15 | 8.74 | |
| 50 | 1.50 | 0.13 | 8.85 |
ELISA napon belüli és napközi pontosság
| Koncentráció (ng/ml) . | Az absz. átlaga . | SD . | CV% . | |
|---|---|---|---|---|
| Napközi pontosság (n = 8) | ||||
| 0 | 3.30 | 0.04 | 1.06 | |
| 5 | 2.07 | 0.09 | 4.18 | |
| 10 | 1.83 | 0.04 | 2.04 | |
| 25 | 1.57 | 0.06 | 3.99 | |
| 50 | 1.40 | 0.02 | 1.46 | |
| Napközi pontosság (n = 80) | ||||
| 0 | 3.44 | 0.12 | 3.60 | |
| 5 | 2.28 | 0.20 | 8.70 | |
| 10 | 1.99 | 0.18 | 9.02 | |
| 25 | 1.67 | 0.15 | 8.74 | |
| 50 | 1.50 | 0.13 | 8.85 |
| Koncentráció (ng/ml) . | Az absz. átlaga . | SD . | CV% . | |
|---|---|---|---|---|
| Napközi pontosság (n = 8) | ||||
| 0 | 3,30 | 0 .04 | 1.06 | |
| 5 | 2.07 | 0.09 | 4.18 | |
| 10 | 1.83 | 0.04 | 2.04 | |
| 25 | 1.57 | 0.06 | 3.99 | |
| 50 | 1.40 | 0.02 | 1.46 | |
| Napközi pontosság (n = 80) | ||||
| 0 | 3.44 | 0.12 | 3.60 | |
| 5 | 2.28 | 0.20 | 8.70 | |
| 10 | 1.99 | 0.18 | 9.02 | |
| 25 | 1.67 | 0.15 | 8.74 | |
| 50 | 1.50 | 0.13 | 8.85 |
A vizsgálat stabilitása és eltarthatósága
A termék eltarthatósági ideje úgy határozható meg, mint az az időtartam, amely alatt az alapvető teljesítményjellemzők meghatározott kezelési körülmények között fennmaradnak (33). A klinikai reagensekkel szemben támasztott ezen követelmény teljesítése érdekében gyorsított stabilitási vizsgálatot végeztek a kereskedelmi termék hozzávetőleges eltarthatósági idejének meghatározására. A DPH-HRP enzimkonjugátumot 14 napig 37 °C-on tartották, és ez idő alatt időközönként megvizsgálták, majd összehasonlították a teljesítményét a 4 °C-on tárolt, hűtött gyógyszer-enzimkonjugátummal. A dózis-válasz görbét 10, 50 és 100 ng/ml kalibrációs szinteken futtattuk szintetikus vizeletben a 14 napos időszak alatt. A vizsgálat során megállapították, hogy a teljes 2 hetes gyorsított időre vonatkozó vizsgálat során a vizsgálat csaknem azonos dózis-választ mutatott. Ez a 14 napos gyorsított idejű vizsgálat legalább 18 hónapos valós idejű stabilitásnak felel meg 4°C-on (33). Az adatokat a 4. ábra mutatja.
gyorsított stabilitási vizsgálat.
gyorsított stabilitási vizsgálat.
Autentikus minták
A vizsgálat validálása érdekében egy héten keresztül különböző időpontokban vizeletmintákat nyertünk öt önkéntes személytől, akik gyakori allergiás tünetek miatt rendszeresen használnak terápiás céllal difenhidramint. Mind az öt önkéntest megkérték, hogy töltsenek ki egy kérdőívet, amelyben az összes szedett gyógyszerüket feltüntették, és megjegyezték, hogy más gyógyszereket nem tüntettek fel. Húsz mintát gyűjtöttek be, amelyeket először ELISA-val vizsgáltak, majd LC-MS-MS segítségével megerősítettek. Minden vizeletmintát 1:20 arányban 100 mM foszfát pufferelt sóoldattal (pH 7,0) előhígítottunk az ELISA elvégzése előtt. Hat minta mindkét módszerrel negatívnak bizonyult, míg 14 minta ELISA-val pozitívnak bizonyult, amelyből 1 minta negatív volt LC-MS-MS-sel megerősítve. Ennek oka az lehetett, hogy az LC-MS-MS által megállapított DPH mennyisége az adott mintában közel volt az 50 ng/ml-es határértékhez. A pozitív vizeletminták 60 és 700 ng/ml közötti DPH-tartalmat mutattak ki. Tíz kontroll vizeletmintát is készítettek szintetikus negatív vizelet alacsony és magas pozitív difenhidramin-koncentrációval történő dúsításával, és tovább elemezték a vizsgálatban. Az eredmények mind pozitívak voltak az ELISA segítségével, és korreláltak az LC-MS-MS megerősítő adataikkal.
A vérvizsgálat validálásához post mortem mintákat használtunk. Húsz postmortem vérmintát szereztek be a LA megyei halottkém laboratóriumából. Minden vérmintát 1:10 arányban előhígítottunk 100 mM foszfát pufferelt sóoldattal (pH 7,0) az elemzés előtt. Mind a 20 minta ELISA-vizsgálattal pozitívnak bizonyult, és összehasonlítottuk a GC-MS megerősítő adataikkal, amelyeket szintén a halottkémi laboratórium bocsátott rendelkezésünkre, és amelyek azt mutatták, hogy a DPH-koncentrációk széles skáláját tartalmazzák < 100 és 870 ng/ml között. Bár az egyik minta a GC-MS 100 ng/ml-es mennyiségi meghatározási határértékénél kevesebbet igazolt, a DPH-t az ELISA-eljárás segítségével mégis azonosították. E vizsgálat célja az ELISA-módszer validálása volt egy ismert megerősítő eljárással, és nem a koncentrációk értelmezésére tett kísérlet. E vizsgálat következtetése az, hogy az ELISA-módszer képes a DPH terápiás szintjének, valamint a sokkal magasabb postmortem szinteknek a kimutatására, és ezért könnyen alkalmazható az ittas vezetés okozta kábítószeres megbetegedések szűrésére, valamint a halálos kimenetelű esetekre.
Következtetések
A DPH egy vény nélkül kapható gyógyszer, amelyet számos, vezetéssel kapcsolatos balesethez, valamint halálos kimenetelű balesethez kapcsolnak. Ezért egy ELISA-szűrés hasznos lenne a vény nélkül kapható gyógyszerek, például antihisztaminok jelenlétének meghatározására a vezetéssel kapcsolatos helyzetekben nyert mintákban. Ez a cikk egy rendkívül érzékeny és specifikus ELISA-szűrési módszer kifejlesztését írja le a difenhidramin kimutatására vizelet- és vérmátrixokban, <10%-os pontossággal. A szerzők legjobb tudomása szerint ez az első immunpróba-módszer, amelyet a DPH kimutatására fejlesztettek ki emberi testfolyadékokban. Ez a módszer követi az ajánlott irányelveket a vizeletben 50 ng/ml és a vérben 25 ng/ml határértékre vonatkozóan a DUID-ügyekben. A módszer érvényességét hiteles vizelet- és vérmintákkal is ellenőrizték, és az ELISA-adatok korreláltak az LC-MS-MS és GC-MS megerősítő eredményekkel. Bár az elemzett minták egy része boncolás utáni esetekből származott, az ezekből kapott eredmények a vizsgálat alacsony LOD értékével együtt egyértelműen bizonyítják a vizsgálat alkalmazhatóságát a közúti baleseteknél, ahol a DPH kisebb mennyiségét lehet kimutatni. Bizonyos fokú keresztreaktivitás volt megfigyelhető bizonyos triciklikus vegyületekkel, amelyek szerkezetileg hasonlóak a DPH-hoz; az ilyen vegyületekből származó hamis pozitív eredmények azonban a megerősítési szakaszban kiküszöbölhetők. További vizsgálatokat kell végezni a triciklikus vegyületekkel kapcsolatos keresztreaktivitási problémák kiküszöbölése és a hasonló antihisztaminokkal való javítás érdekében.
Köszönet
Ezt a munkát az Immunalysis Corporation finanszírozásával támogatták. Szeretnénk köszönetet mondani Dr. James Soaresnek és Michael Vincent úrnak a kézirat elkészítése során folytatott értő beszélgetésekért, Cynthia Coulter asszonynak a vizeletminták LC-MS-MS elemzéséért, valamint Dan Anderson úrnak a LA megyei halottkémi laboratóriumban a pozitív vérminták biztosításáért. Köszönetet mondunk továbbá minden önkéntesnek, aki vizeletmintákat biztosított.
. ,
,
8th ed.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
pg.
,
,
Jr.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
Jr.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
Jr.
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
. ,
,
, vol.
8th ed
(pg.
–
)
. ,
,
, vol.
8th ed
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.