Az immunhisztokémia (IHC) egy hatékony mikroszkópián alapuló technika a sejtkomponensek, például fehérjék vagy más makromolekulák láthatóvá tételére szövetmintákban. Az IHC erőssége az intuitív vizuális kimenet, amely feltárja a célfehérje létezését és lokalizációját a különböző sejttípusok, biológiai állapotok és/vagy a komplex szöveteken belüli szubcelluláris lokalizáció összefüggésében.
Az IHC technikát az 1940-es években találták fel (Coons, Creech, & Jones, 1941), és rutinszerűen fontos eszközként használják az egészségügyben és a patológiában pl. diagnosztikai célokra vagy a betegek rétegzésére az optimális kezelési sémákhoz. Az IHC-t széles körben használják a kutatásban is, ahol az érdeklődésre számot tartó molekulákat elemzik, hogy molekuláris, sejtszinten vagy szöveti szinten tanulmányozzák szerepüket mind az egészséges, mind a beteg sejtekben és szövetekben. A szövetekben lévő célpontok IHC vagy IHC-alapú módszerekkel történő vizualizálásának számos különböző módja van, és számos protokoll létezik a különböző alkalmazásokhoz és vizsgálatokhoz. Bár az IHC általában robusztus és bevált módszer, az új próbák gyakran gondos optimalizálást igényelnek a szövetektől vagy a célfehérje, a kötőanyag-molekula és/vagy a riporterrendszer tulajdonságaitól függően. A sokéves technikai fejlődés és a specifikus kötőmolekulák rendkívül megnövekedett elérhetősége nagymértékben javította az IHC hasznosságát és alkalmazási területeit. Az IHC-alapú technikák és reagensek terén elért fejlődés a tudósok és az egészségügyi szolgáltatók számára pontosabb eszközöket, vizsgálatokat és biomarkereket tett lehetővé. Emellett a technikai fejlődés lehetővé tette például több fehérje nagy érzékenységű egyidejű kimutatását ugyanabban a mintában, valamint a fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatását (lásd Proximity Ligation Assay).
A klasszikus IHC vizsgálatot az 1. ábra szemlélteti, és egy szövetmintában egyetlen fehérje-célpont által kifejezett epitópok kimutatását jelenti egy “elsődleges antitest” segítségével, amely képes ezeket az epitópokat nagy specificitással megkötni. Az epitóp-antitest kötődést követően egy “másodlagos antitestet” adunk hozzá, amely képes az elsődleges antitestet nagy specificitással megkötni. A másodlagos antitestet egy riportmolekulához kötik, és az antitest-antitest kötődési eseményt követően kémiai szubsztrátot adnak hozzá, amely a riportmolekulával reagálva színes csapadékot hoz létre a teljes epitóp-antitest komplex helyén.
1. ábra. Az immunhisztokémia alapelve.
A sematikus ábrán (1. ábra) egy formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetet festünk meg egy specifikus fehérjecélpont ellen irányított primer ellenanyaggal. Az elsődleges antitestet tartalmazó oldatot adnak a szövetszelvényhez, és az antitesteknek hagynak egy kis időt, hogy megtalálják a célpontjukat, és ahhoz kötődjenek. Ezt a lépést követően a nem kötött és felesleges antitesteket kimossuk, majd hozzáadjuk a másodlagos antitestet. A másodlagos antitestet, amely egy linker molekulát hordoz tormaperoxidáz (HRP) enzimekkel, szintén hagyjuk egy kis időt, hogy az elsődleges antitesthez kötődjön, majd újabb mosási lépés következik. Ezt követően 3,3′ diaminobenzidin (DAB) hozzáadására kerül sor. A HRP enzim a DAB-szubsztrátot barnás színű csapadékká alakítja át, amely a reakció helyén a szövetben lerakódik, így láthatóvá válik, hogy az elsődleges antitest hol kötötte meg először a célpontját.
Technológia
Szövet előkészítés
A szövet központi szerepet játszik a kísérletben, és fontos, hogy úgy dolgozzák fel, hogy az epitópok és a megfelelő morfológia megmaradjon. Az IHC-hez a leggyakoribb feldolgozás a formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) szövetblokkok elkészítése. A formalinos fixálás célja a szövetben lévő fehérjék kémiai keresztkötése. Ez megszünteti az összes sejtfolyamatot, és a sejtkomponenseket azon a helyen és abban a konformációban fagyasztja le, amelyben a rögzítéskor voltak, és megakadályozza a lebomlást is. A megfelelő fixálás után a szövetet tovább feldolgozzák, és végül paraffinblokkokba ágyazzák, amelyeket aztán mikrotom segítségével vékony (általában 4-10 µm-es) szeletekre vágnak. A metszeteket üveglemezekre helyezik át, és a további feldolgozás előtt hagyják megtapadni.
A formalinon kívül más rögzítési módszereket is alkalmaznak néha. Ezek közé tartoznak más típusú aldehidek vagy különböző alkoholos oldatok használata. A legjobb fixálószer kiválasztása nagymértékben függ a vizsgálattól. Az FFPE egyik gyakori alternatívája a fagyasztott szövetminták készítése. Ebben az esetben a szövetet krioprotektív közegbe ágyazzák és lefagyasztják, a fixálást pedig a metszés után végzik el. A fagyasztott szöveteket kriosztátokban szeletelik, és előnyük a rövid feldolgozási idő és az érzékeny epitópok jobb megőrzése, de gyakran rosszabbak lehetnek az FFPE szöveteknél a szövettani morfológia megőrzése szempontjából.
Az antigén (epitóp) kinyerése
A keresztkötő fixálószerekkel, mint a formalin, vagy a fixáló közegben töltött túl hosszú idővel kapcsolatos aggodalom az epitópok elfedése, ami akadályozhatja az elsődleges antitestet a célpontjához való kötődésben. Különösen FFPE minták esetében gyakran szükség van a kémiai keresztkötés egy részének visszaállítására és az epitópok “visszaszerzésére”, mielőtt a tényleges IHC-t folytatnánk. Számos antigén-visszanyerési protokoll áll rendelkezésre, és a fő stratégiák közé tartozik a szövetlemez hővel, emésztőenzimekkel, detergensekkel vagy ezek kombinációjával történő kezelése. Az FFPE minták antigén-visszanyerésének legelterjedtebb módszere a szövetlemezek savas citrát pufferben történő, kb. 15-20 perces nyomás alatti forralása.
Az antitest-kötés
A kötőmolekula minősége és specificitása kulcsfontosságú minden IHC-alapú technika esetében, és a kötőanyag kiválasztása közvetlenül befolyásolhatja a vizsgálat eredményét, megbízhatóságát és esetleg értelmezését is. Az antitestek messze a leggyakrabban használt kötőmolekula-típus az IHC-hez, és bár a legtöbb antitest képes megfelelően detektálni a megfelelő, érdeklődésre számot tartó molekulát, a tervezett célpontra vonatkozó specifitásuk is nagymértékben eltérhet. A nagy specificitású antitestek ezért megbízhatóbbak az “on-target” kötődés értelmezésekor, mivel kevés vagy semmilyen “off-target” kötődést vagy “hátteret” nem produkálnak. A kevésbé specifikus antitestek több célponton kívüli kötődést produkálhatnak, és a keletkező háttér esetleg zavarja a valódi célponton belüli jelek helyes értelmezését. Az antitesteknek két fő típusa van: a poliklonális antitestek, amelyek a célpont különböző epitópjaihoz kötődő antitestek heterogén keveréke, és a monoklonális antitestek, amelyek mind ugyanazt az epitópot kötik. A poliklonális antitestek gyakran nagyon hatékonyak, mivel képesek ugyanazon a célponton több epitópot kimutatni és megkötni. Az általuk megkötött epitópok azonban gyakran rosszul meghatározottak, és a többszörös és eltérő epitóp-specifikussággal együtt jár a célponton kívüli kötődési események és a háttérzaj nagyobb valószínűsége. A poliklonális antitestek hatékonysága azonban előnyös lehet, mivel a célmolekula körüli kötődési események koncentrációja általában felülmúlja a potenciális háttérzajt. Hátránya, hogy a poliklonális antitestek általában korlátozott erőforrások, mivel állati szérumokból származnak. A monoklonális antitestek ezzel szemben nagyobb folyamatossággal rendelkeznek, mivel hibridoma-sejtvonalakban állíthatók elő. A monoklonális antitestek gyakran az epitópkötés szempontjából is jól definiáltak, de még így is nehezen értelmezhető eredményeket hozhatnak, ha a specificitás alacsony, vagy ha a célepitóp kis mennyiségben van jelen.
Az antitest koncentrációjának gondos optimalizálása és titrálása szükséges minden egyes vizsgálathoz, mivel az eredmény nemcsak az antitest specifitásától és a célpont iránti affinitásától függ, hanem a mintában jelen lévő célponton belüli és potenciális célponton kívüli epitópok koncentrációjától és elérhetőségétől is. Ha túl sok antitestet adunk a mintához, az megnöveli a lehetséges alacsony affinitású, célponton kívüli kötődési események számát, amint a célponton lévő epitóp(ok) telítődnek kötőanyagokkal. Az antitestkoncentráció csökkentésével a célon kívüli kötődési események ritkábbá válnak, mivel általában alacsonyabb affinitással rendelkeznek, mint a célon belüli kötődési események. Ha alacsony affinitású antitestet használva próbáljuk csökkenteni a hátteret, az azzal a kockázattal jár, hogy a célzott jelek egyidejűleg annyira meggyengülnek, hogy hamis negatív eredményt adnak.
Az IHC-alapú technikákban néha használt egyéb kötőmolekula-típusok közé tartoznak az affibodyk, peptidek, antitestfragmentumok vagy más kismolekulák.
Detektáló rendszerek
Az IHC elvégzésének teljes célja, hogy vizuális képet kapjunk arról, hogy a kísérleti szövetben hol található a célpont, és lehetőleg információt nyerjünk a célpont heterogén sejtpopulációk és/vagy szubcelluláris lokalizációk közötti expressziós mintázatáról is. Ezt példázza a 2. ábra, amely azt szemlélteti, hogy különböző antitesteket használnak a különböző sejt- vagy szövetkompartmentek vizualizálására egy komplex szöveten belül. A célpont-antitest kölcsönhatás vizualizálásához valamilyen detektáló rendszerre van szükség, amely megfigyelhető festéket vagy jelet produkál. A detektáló rendszer kísérletbe történő bevezetésének leggyakoribb módszere egy olyan másodlagos antitest használata, amely egy előre kötött riportmolekulát, azaz enzimet vagy fluorofort hordoz. A másodlagos antitestek általában specifikusan egy másik állatfajból származó antitestmolekulákra irányulnak. Például, ha az elsődleges antitestet nyúlban tenyésztik, akkor a másodlagos antitestet egy másik állatban kell tenyészteni, és specifikusan a nyúl antitestekre kell irányítani.
| Esophagus | Nagyítás | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Hematoxilin festés | Nem antitestfestés | ||||
| TP63 CAB000083 |
Nukleáris festés | ||||
| EGFR CAB000035 |
Membrán festődés | ||||
| G6PD HPA000247 |
Citoplazmatikus festődés | ||||
| LAMB2 (Laminin) CAB000053 |
Kötőszövet |
Ábra 2. Különböző fehérje célpontok vizualizálása komplex szövetekben. A jobb oldali oszlop a bal oldali oszlopban található megfelelő képek nagyítását mutatja.
Az IHC-képen (2. ábra) az emberi nyelőcső négy különböző antitesttel festett, egymást követő metszetei lehetővé teszik a különböző fehérjeexpressziós mintázatok közvetlen összehasonlítását a szöveten belül és a szubcelluláris kompartmenteken belül. A felső képeken az összehasonlításhoz csak hematoxilinnel ellenfestettek. A p63 antitest a sejtmagokat festi meg a nyelőcsőhám bazális részében található sejtpopulációban. Az EGFR (epidermális növekedési faktor receptor) ellenanyag látszólag ugyanazt a sejtpopulációt festi, mint a p63, de sejtmagok helyett sejtmembránokat fest. A G6PD (glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz) antitest a nyelőcső hámsejtek szélesebb repertoárjának citoplazmáját, valamint a kötőszövetben található sejteket is megfesti. A Laminin (LAMB2) antitest csak a nyelőcső alatti kötőszövetben található sejteket és struktúrákat festi meg.
FFPE szövetminták esetében a legelterjedtebb kimutatási módszer az enzimatikus reakciók alkalmazása, amelyek az antitest kötődésének helyén színes csapadékot hoznak létre. A másodlagos antitestek ezután egy enzimet, pl. torma-peroxidázt (HRP) vagy alkalikus foszfatázt (AP) hordoznak, amelyek képesek az olyan kromogéneket, mint a 3,3′ diaminobenzidin (DAB) vagy az 5-brom-4-klór-3-indolil-foszfát/p-nitroblue tetrazolium-klorid (BCIP/NBT) barna vagy kékes színű csapadékká alakítani, amely a reakció helyén a szövetben lerakódik. A kromogén festékek fénymikroszkópiával megfigyelhetők, és általában hosszú időn keresztül nagyon stabilak, ami előnyös, ha a kísérletet archiválni vagy egy későbbi időpontban felülvizsgálni kell.
Fagyasztott szöveti metszetekhez gyakrabban használnak fluorofórhoz kötött másodlagos antitesteket, amelyek a megfelelő hullámhosszú fény által gerjesztve specifikus színt (általában zöld, vörös vagy kék) bocsátanak ki. Ráadásul a fluoroforok általában nem stabilak hosszú ideig. A fluoroforok használatának előnye azonban az, hogy egyszerű módszert biztosítanak a kettős jelölésű kísérletek elvégzésére, amikor több célpont ellen több antitestet vizsgálnak ugyanabban a mintában. A másodlagos antitesteket különböző elsődleges antitestek ellen kell célozni, és különböző fluorofórokhoz kell kötni. A különböző másodlagos antitesteket ezután külön-külön kell megfigyelni azáltal, hogy egymás után különböző hullámhosszúságú fénnyel gerjesztjük őket. Ezeket a különböző gerjesztési eredményeket külön képként (vagy színcsatornaként) mentjük el, és később egymásra helyezhetjük őket, hogy következtetni tudjunk a fehérjék ko-lokalizációjára stb.
A riportert hordozó másodlagos antitestek használata a detektáláshoz önmagában egy erősítési lépés, mivel több másodlagos antitest képes egyetlen elsődleges antitestet megkötni, de néha további erősítési lépésekre van szükség a kísérlet jelének és érzékenységének növelése érdekében. Ilyen esetekben a másodlagos antitest ehelyett hordozhat “linker molekulákat”, például biotin polimereket, amelyek képesek nagyobb számú riporter molekulát toborozni a következő lépésekben. A jelek felerősítésének ez a stratégiája mind az enzimatikus, mind a fluoreszcens detektálási módszereknél hasznos.
Ellenefestés
A kromogéneket használó immunhisztokémiai festésnek gyakran előnyös, ha ellenfestéket alkalmaznak, amely fokozza a kontrasztot és megkönnyíti a szövettani jellemzők megfigyelését. Az FFPE mintákhoz leggyakrabban használt ellenfestéktípus a hematoxilin, amely a sejtek citoplazmáját halvány kékes színnel, a sejtmagokat pedig sötétebb kékes árnyalattal festi meg. A fluoreszcens festéseket általában nem ellenfestik hematoxilinnel, mivel a kimutatási módszer nem fénymikroszkópián alapul. Ehelyett a fluoreszcencia ellenfestésének leggyakoribb módja a sejtmagok jelölése nukleinsavakat megkötő fluoreszcens festékek hozzáadásával. A tényleges immunhisztokémiai reakció után az egyetlen hátralévő lépés a minta fedőlemezzel való lefedése és lezárása a védelem és a hosszú távú tárolás érdekében. A legelterjedtebb módszer a fedőlemez “felragasztása” a mintára a kereskedelemben kapható, kifejezetten erre a célra gyártott gyanták segítségével.
Konkrét példák
Az IHC-t széles körben alkalmazzák mind a kutatásban, mind a klinikai gyakorlatban. A Human Protein Atlas (HPA) projekt kiváló példa arra, hogy a nagy áteresztőképességű IHC-t hogyan használják a humán proteom nagyszabású feltérképezésére számos szövetben, rákos megbetegedésben és sejtben. A HPA-projektben egy racionalizált, házon belüli, nagyméretű antitestgyártási lánc megkönnyíti a specifikus antitestek előállítását, amelyeket az alapvető jellemzési és validálási rendszereket követően egyetlen kísérlet során több száz szövetmagot tartalmazó szövetmikrotáblák szisztematikus festésére használnak. A HPA által alkalmazott IHC-rendszer nagymértékben támaszkodik a protokollok szabványosítására és gépi automatizálására, de az egyes antitestek optimális titrálásának értékelését kézzel végzik, mielőtt az antitestet jóváhagyják a teljes szövetkészleten történő festéshez. Minden egyes festett szövetmagot megjegyzésekkel látnak el a szövetek és sejttípusok immunhisztokémiai festése tekintetében, majd ezt követően nagy felbontású képként közzéteszik a webportálon, hogy bárki szabadon megtekinthesse.
A klinikai gyakorlatban az IHC-t elsősorban a patológián belül használják, hogy segítsék az orvosokat a szövetminták értékelésében az egészséges és a beteg állapotok tekintetében, a diagnózisok felállításában és a különböző ráktípusok molekuláris altípusainak meghatározásában. Egy konkrét példa, amikor az IHC-t diagnosztikusan használják, amikor a patológusok metasztatikus tumormintát kapnak, és az elsődleges tumor szöveti eredete ismeretlen. Ezekben az esetekben a patológusok különböző antitestek panelét használják, amelyek szövetspecifikus fehérjéket céloznak, például prosztata-specifikus antigént prosztatarák esetén, vagy ösztrogénreceptort nőgyógyászati rákok esetén, vagy citokeratin 20-at gasztrointesztinális rákok esetén (Gremel et al., 2014). Miután megtörtént az átfogó osztályozás, további szövetspecifikus antitesteket használnak az elsődleges daganat eredetének további pontosabb meghatározásához. Ez az információ hasznos a legjobb vagy legmegfelelőbb gyógyszeres terápiás stratégia kiválasztásához és/vagy a primer tumor helyének meghatározásához a sugárkezelés és/vagy műtét céljából.
Hivatkozások és hivatkozások
A rákdiagnosztikában gyakran használt antitestek:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopathology. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
A review on validating antibodies for IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – Nyílt hozzáférésű adatbázis a nyilvánosan elérhető antitestekről és azok hasznosságáról különböző alkalmazásokban:
IHC world – Protokollok, fórum, termékek és még sok más:
A YouTube klip az IHC illusztrálása a BioGenexLaboratories-tól: