Gertrude Stein 1874. február 3-án született a pennsylvaniai Alleghenyben, jómódú német-zsidó bevándorlók gyermekeként. Hároméves korában családja előbb Bécsbe, majd Párizsba költözött. Amerikába 1878-ban tértek vissza, és a kaliforniai Oaklandben telepedtek le. Édesanyja, Amelia 1888-ban rákban, édesapja, Daniel pedig 1891-ben halt meg.
Stein 1893 és 1897 között a Radcliffe College-ba járt, ahol a neves pszichológus, William James vezetésével pszichológiára szakosodott. Miután elhagyta a Radcliffe-et, beiratkozott a Johns Hopkins Egyetemre, ahol négy évig orvostudományt tanult, és 1901-ben hagyta ott. Stein egyik intézményben sem szerzett hivatalos diplomát.
1903-ban Stein Párizsba költözött Alice B. Toklasszal, egy fiatalabb San Franciscó-i barátnőjével, aki egész életében társa és titkára maradt. A pár több mint harminc évig nem tért vissza az Egyesült Államokba. Az első világháború idején együtt önkénteskedtek, ellátmányt szállítottak a franciaországi kórházakba.
Toklasszal és bátyjával, Leóval, aki művészeti kritikus és festő volt, Stein a bal parton vett ki egy lakást. Otthonuk, a rue de Fleurus 27. szám alatt hamarosan számos fiatal művész és író, köztük Henri Matisse, Ezra Pound, Pablo Picasso, Max Jacob és Guillaume Apollinaire találkozóhelyévé vált.
A művészetben az “új” szenvedélyes szószólója volt, irodalmi barátságai olyan különböző írókkal bővültek, mint William Carlos Williams, Djuana Barnes, F. Scott Fitzgerald, James Joyce és Ernest Hemingway. Hemingwaynek köszönhette Stein az “elveszett nemzedék” kifejezést, amellyel a két világháború között külföldön élő külföldi írókat jellemezte.
1913-ra Stein a kubista festők támogatása és egyre avantgárdabbá váló írói munkássága miatt szakított testvérével, Leóval, aki Firenzébe költözött. Első könyve, a Három élet 1909-ben jelent meg. Ezt követte a Tender Buttons (Claire Marie) 1914-ben.A Tender Buttons világosan megmutatta, milyen mély hatást gyakorolt a modern festészet az írói munkásságára. Ezekben a kis prózaversekben a képek és mondatok gyakran meglepő módon állnak össze – hasonlóan a kubista festészethez. Írásait, melyekre jellemző, hogy a szavakat inkább asszociációik és hangzásaik, mintsem jelentésük miatt használja, más művészek és írók jelentős érdeklődéssel fogadták, de nem találtak széles közönségre.
Stein legnagyobb hatású művei közé tartozik a The Making of Americans (1925); a How to Write (1931); a The Autobiography of Alice B. Toklas (1933), amely bestseller volt; és a Stanzas in Meditation and Other Poems (1956). Sherwood Anderson a Geography and Plays (1922) bevezetőjében azt írta, hogy írói munkássága “az élet újjáépítéséből és teljes újjáalakításából áll, a szavak városában.”
Stein 1946. július 27-én halt meg a Neuilly-i Amerikai Kórházban, operálhatatlan rákban.