00:00:07.25Hi my name is Jennifer Doudna from UC Berkeley
00:00:09.26and I’m here today to tell you about how we uncovered
00:00:12.26egy új genommérnöki technológiát.
00:00:15.07Ez a történet a bakteriális immunrendszerrel kezdődik
00:00:20.12Ez azt jelenti, hogy megértjük, hogyan védekeznek a baktériumok
00:00:22.14a vírusfertőzés ellen.
00:00:24.26Kiderült, hogy sok baktérium
00:00:28.04a kromoszómájukban,
00:00:30.09amelyet itt látnak
00:00:32.15a fekete gyémántokban látható ismétlődések sorozatát
00:00:36.18amelyek között szekvenciák vannak
00:00:40.19. amelyek vírusokból származnak
00:00:00:43.08és ezeket a mikrobiológusok vették észre
00:00:46.20amelyek a bakteriális genomokat szekvenálták, de senki sem tudta
00:00:50.10milyen funkciója lehet ezeknek a szekvenciáknak
00:00:00:53.06mígnem észrevették, hogy ezek a gének egy sor olyan génnel együtt is előfordulnak, amelyek gyakran olyan fehérjéket kódolnak, amelyek homológiát mutatnak olyan enzimekkel, amelyek érdekes dolgokat csinálnak, mint például a DNS-javítás.
00:01:01:10.12Az volt a hipotézis, hogy ez a rendszer
00:01:14.04 amit CRISPR-nek neveztek el
00:01:16.08 ami egy rövidítés az ilyen típusú ismétlődő lokuszokra
00:01:19.14hogy ezek a CRISPR rendszerek valóban lehetnek
00:01:22.29egy megszerzett immunrendszer a baktériumokban
00:01:26.00amely lehetővé teszi, hogy szekvenciákat integráljanak
00:01:29.06vírusokból, és később valahogyan felhasználják
00:01:32.07a sejt védelmére a fertőzéstől
00:01:35.26azzal a vírussal.
00:01:37.05Szóval ez egy érdekes hipotézis volt
00:01:39.11és mi is bekapcsolódtunk ennek tanulmányozásába
00:01:41.18a 2000-es évek közepén, közvetlenül a publikáció után
00:01:44.15három olyan cikk megjelenése után, amelyek rámutattak a vírusszekvenciák beépítésére ezekbe a genomi lokuszokba.
00:01:01:52.07És a következő néhány évben kiderült, hogy valójában ezek a CRISPR rendszerek
00:01:01:58.08a baktériumokban valóban szerzett immunrendszerek
00:02:01.18ezidáig senki sem tudta, hogy a baktériumok
00:02:04.24a baktériumok valóban képesek alkalmazkodni
00:02:08.08a sejtbe jutó vírusokhoz
00:02:10.29de ez az egyik módja annak, hogy ezt megteszik
00:02:12.14és ez magában foglalja az idegen DNS
00:02:15.17 kimutatását, amelyet befecskendeznek, mint ahogyan ebben a példában látható
00:02:18.04egy vírusból, amely bejut a sejtbe
00:02:20.07a CRISPR rendszer lehetővé teszi a vírus DNS molekulák rövid darabjainak integrálását
00:02:29.15a CRISPR lokuszba
00:02:31.07és a második lépésben
00:02:33.27a CRISPR RNS biogenezis
00:02:38.20. Ezek a CRISPR szekvenciák ténylegesen átíródnak
00:02:42.20a sejtben RNS-darabkákká
00:02:45.15amelyeket később a CAS gének által kódolt fehérjékkel együtt
00:02:48.23használnak fel
00:02:52.09ezek a CRISPR-asszociált gének
00:02:54.01az interferáló vagy interferencia komplexek
00:02:58.12képzéséhez, amelyek képesek felhasználni az RNS molekulák
00:03:01.17formájú információit, hogy bázispárokat
00:03:04.08kapcsoljanak a vírus DNS megfelelő szekvenciáival.
00:03:07.18Egy nagyon ügyes módszer, amit a baktériumok kitaláltak, hogy a betolakodó baktériumokat
00:03:13.06és a szekvencia információt ellenük fordítják.
00:03:17.00A saját laboratóriumomban
00:03:20.21hosszú ideje nagyon érdekel bennünket
00:03:23.09annak megértése, hogy az RNS molekulák
00:03:26.03a sejtek segítségével hogyan szabályozzák a fehérjék kifejeződését
00:03:32.00.03a genomból.
00:03:35.05Ez tehát szintén egy nagyon érdekes
00:03:37.27példának tűnt, és
00:03:39.18kezdtük tanulmányozni az alapvető molekuláris mechanizmusokat
00:03:42.24melyek által ez az útvonal működik.
00:03:45.01És 2011-ben elmentem egy tudományos konferenciára
00:03:49.23és találkoztam egy kollégámmal,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier-vel, aki ezen a képen
00:03:56.10a szélső bal oldalon látható és Emmanuelle laboratóriumában
00:03:58.14mikrobiológiai problémákkal foglalkozik, és ők
00:04:02.11különösen a baktériumok iránt érdeklődnek
00:04:04.00amelyek emberi kórokozók.
00:04:06.01Egy olyan szervezetet tanulmányozott, amelyet
00:04:08.03Streptococcus pyogenes, ami egy baktérium
00:04:11.15amely nagyon súlyos fertőzéseket okozhat az emberekben
00:04:14.25és ami érdekes volt ebben a baktériumban, hogy
00:04:16.25van egy CRISPR rendszere és ebben a szervezetben
00:04:19.06volt egy gén, amely egy fehérjét kódolt
00:04:21.27az úgynevezett Cas9
00:04:23.12amelyről genetikailag kimutatták, hogy szükséges
00:04:26.09a CRISPR rendszer működéséhez
00:04:28.16a Streptococcus pyogenes-ben,
00:04:30.23de senki sem tudta akkoriban, hogy mi a funkciója
00:04:33.05annak a fehérjének.
00:04:34.20És így összeálltunk és toboroztunk
00:04:37.20embereket a saját kutató laboratóriumainkból
00:04:40.26,hogy elkezdjük tesztelni a Cas9 funkcióját.
00:04:43.17A projekt kulcsemberei
00:04:45.20a fényképen látható
00:04:48.00a középen Martin Jinek
00:04:50.03aki a saját laborom posztdoktori munkatársa
00:04:52.17és mellette a kék ingben
00:04:54.22 Kryztof Chylinski, aki hallgató volt
00:04:57.20Emmanuelle laborjában
00:04:58.26és így ez a két srác együtt
00:05:00.21Ines Fonfara-val, aki a jobb szélén van,
00:05:02.10a posztdoktor Emmanuelle
00:05:04.01kezdtek kísérletezni az Atlanti-óceánon túl
00:05:07.25és megosztani az adataikat.
00:05:10.09És azt találták, hogy
00:05:13.06A Cas9 valójában egy lenyűgöző fehérje
00:05:16.04amely képes kölcsönhatásba lépni a DNS-sel
00:05:19.28és kettősszálú törést generálni
00:05:22.02a DNS-ben olyan szekvenciáknál, amelyek megegyeznek
00:05:25.06a vezető RNS szekvenciájával
00:05:27.08és ezen a dián azt látjátok, hogy a vezető RNS
00:05:30.10és a vezető szekvenciája narancssárga
00:05:32.11amely bázispárokat alkot a kettős spirális DNS egyik szálával
00:05:34.18a kettős spirális DNS
00:05:37.11és nagyon fontos, hogy ez az RNS
00:05:39.28interakcióba lép egy második RNS molekulával
00:05:42.09a tracr, amely egy olyan szerkezetet alkot
00:05:46.03amely a Cas9 fehérjét
00:05:47.29mivel ez a két RNS és egyetlen fehérje
00:05:50.13 a természetben az, ami szükséges
00:05:52.23hogy ez a fehérje felismerje
00:05:56.05a normális esetben vírus DNS-eket
00:05:58.11a sejtben, és a fehérje
00:06:01.13a képes ezeket feldarabolni,
00:06:02.14szó szerint a kettős spirális DNS-t felbontva.
00:06:05.24És amikor erre rájöttünk
00:06:08.14gondoltuk: nem lenne csodálatos
00:06:10.26ha valóban egy egyszerűbb rendszert tudnánk létrehozni
00:06:13.29. mint ahogy a természet tette
00:06:15.02azzal, hogy összekapcsoljuk ezt a két RNS molekulát
00:06:18.04olyan rendszert hoznánk létre, ami egyetlen fehérjéből
00:06:20.16és egyetlen irányító RNS-ből állna.
00:06:22.28Az ötlet tehát az volt, hogy alapjában véve
00:06:25.17vegyük ezt a két RNS-t, amit a dia túloldalán látnak
00:06:29.29és aztán alapjában véve összekapcsoljuk őket
00:06:33.19és létrehozzuk azt, amit mi úgy hívunk
00:06:35.04egyetlen vezető RNS-nek.
00:06:36.22Martin Jinek a laborban
00:06:38.25 elkészítette ezt a konstrukciót
00:06:40.21és csináltunk egy nagyon egyszerű kísérletet
00:06:44.22hogy teszteljük, hogy valóban van-e
00:06:46.18programozható DNS hasító enzimünk
00:06:49.29és az ötlet az volt, hogy rövid, egyedi vezető RNS-eket hozzunk létre, amelyek felismerik a különböző helyeket a körkörös DNS molekulában, amit itt látnak, és a vezető RNS-eket úgy terveztük, hogy a vezető RNS-eket úgy terveztük, hogy a vezető RNS-eket úgy terveztük, hogy a vezető RNS-eket úgy terveztük, hogy a vezető RNS-eket úgy terveztük, hogy a vezető RNS-eket úgy terveztük, hogy a vezető RNS-eket úgy terveztük, hogy a vezető RNS-eket úgy terveztük, hogy a vezető RNS-eket úgy terveztük, hogy a vezető RNS-eket úgy terveztük10hogy felismerjék a piros sávokkal jelzett szekvenciákat
00:07:06.17a dián, és a kísérlet az volt
00:07:10.16,hogy vegyük ezt a plazmidot, ezt a cirkuláris DNS molekulát
00:07:13.21és inkubáljuk két különböző restrikciós (vagy vágó) enzimmel,
00:07:18.27Az egyiket SalI-nak hívják, ami elvágja
00:07:21.23a DNS-t, úgymond felfelé, a túlsó végén
00:07:25.05a DNS-t ezen a képen
00:07:26.12a szürke dobozban,
00:07:27.19és a második hely, ami irányított
00:07:31.00az RNS által irányított Cas9
00:07:33.13ezeken a piros színnel jelölt különböző helyeken.
00:07:35.16És egy nagyon egyszerű kísérletben
00:07:37.19végeztük ezt az inkubációs reakciót
00:07:39.26plazmid DNS-sel és ez az eredmény
00:07:43.24és ez az, amit látnak
00:07:45.28ez egy agaróz gél
00:07:47.29amely lehetővé teszi számunkra, hogy elválasszuk
00:07:49.16a DNS hasított molekuláit
00:07:51.20és azt láthatjuk, hogy minden egyes reakció sávban
00:07:54.22különböző méretű DNS molekulát kapunk a kétszeresen emésztett plazmidból
00:08:00.16amelyben a DNS mérete
00:08:03.29megfelel a különböző helyeken történő hasításnak
00:08:06.11a vezér-RNS szekvenciák által irányított
00:08:08.26vörössel jelzett
00:08:10.24ez egy nagyon izgalmas pillanat volt
00:08:12.29egy nagyon egyszerű kísérlet, ami
00:08:15.15olyan “A ha!” pillanat
00:08:17.03 amikor azt mondtuk, hogy tényleg van egy programozható DNS vágóenzimünk
00:08:22.02és hogy be tudjuk programozni egy rövid RNS darabkával
00:08:24.15hogy lényegében bármilyen kettős szálú DNS szekvenciát hasítson
00:08:28.07Azért voltunk annyira izgatottak
00:08:30.23egy olyan enzim miatt, amelyet programozni lehet
00:08:33.19hogy bármilyen szekvencián kettősszálú DNS-törést hozzon létre
00:08:36.01azért, mert
00:08:39.00hogy a tudományos közösségben régóta létezett egy kísérletsorozat
00:08:42.16amely kimutatta
00:08:45.13hogy a sejteknek vannak módszereik a kettős szálú DNS törések javítására
00:08:49.26amelyek változásokhoz vezetnek
00:08:52.02a DNS genomikus információjában
00:08:55.21ez a dia tehát azt mutatja, hogy
00:08:58.20mikor egy kettősszálú törés keletkezik
00:09:01.14mindenféle enzim által, ami ezt megteheti
00:09:04.13 beleértve a Cas9 rendszert is
00:09:06.05ezeket a kettősszálú töréseket a sejtben
00:09:09.07kétféle útvonalon észlelik és javítják
00:09:13.15az egyik a bal oldalon, amely a
00:09:17.26nem-homológ végcsatlakozást
00:09:20.07amelyben a DNS végeit kémiailag ligálják
00:09:24.07vissza egymáshoz, általában egy kis inszerció vagy deléció
00:09:28.25bevezetésével
00:09:26.18a törés helyén
00:09:29.27és a jobb oldalon
00:09:32.01a javítás egy másik módja
00:09:34.00a homológia irányított javítás
00:09:37.22melyben egy donor DNS molekula
00:09:39.14amelynek a szekvenciái megegyeznek azokkal
00:09:43.28a duplaszálú törés helyét szegélyező szekvenciákkal, a törés helyére be lehet építeni a genomba, hogy új genetikai információt vigyünk be a genomba, és így új genetikai információt vigyünk be a genomba.15ez sok tudósnak
00:09:59.04azt a gondolatot adta, hogy ha lenne egy eszköz
00:10:01.04vagy egy technológia, amely lehetővé tenné
00:10:03.05a tudósok vagy kutatók számára, hogy célzott helyeken
00:10:06.12kettősszálú töréseket vezessenek be
00:10:09.00a sejt DNS-ében, akkor együtt
00:10:12.12az összes genomszekvenálási adattal
00:10:14.21amelyek ma már rendelkezésre állnak, ismerjük a
00:10:16.10a sejt teljes genetikai szekvenciáját
00:10:18.21és ha tudnánk, hogy hol történt egy mutáció, ami például egy betegséget okoz, akkor egy ilyen technológiát használhatnánk arra, hogy olyan DNS-t juttassunk be, ami kijavítja a mutációt.00vagy létrehozni egy olyan mutációt
00:10:32.23amelyet egy kutatási környezetben tanulmányozni szeretnél
00:10:35.04Így ennek a technológiának az ereje
00:10:38.28igazából az a gondolat, hogy most már képesek vagyunk létrehozni
00:10:41.20ezeket a fajta kettősszálú töréseket
00:10:43.17azokon a helyeken, amelyeket mi választunk ki, mint tudósok
00:10:46.17azzal, hogy a Cas9-et programozzuk, majd lehetővé tesszük
00:10:48.13a sejt számára, hogy olyan javításokat végezzen, amelyek e törések helyein genomikai változásokat hoznak
00:10:51.04az ilyen törések helyén
00:10:54.15De a kihívás az volt, hogy hogyan hozzuk létre a töréseket, és ezért számos különböző stratégiát dolgoztak ki erre a különböző laboratóriumokban.15legtöbbjük, és itt most két konkrét példát fogok mutatni
00:11:08.21az egyiket cinkujjas nukleázoknak
00:11:12.25és a másikat TAL effektor doméneknek
00:11:15.02ezek mindkettő programozható módon
00:11:11:18.08kettősszálú törések létrehozására a DNS-ben
00:11:20.21melyek a DNS szekvenciák fehérje alapú felismerésére támaszkodnak
00:11:23.29mivel ezek olyan fehérjék
00:11:26.06amelyek modulárisak, és generálhatók
00:11:29.12a modulok különböző kombinációiban
00:11:31.22különböző DNS szekvenciák felismerésére
00:11:34.03ez működik, mint technológia
00:11:37.18de nagyon sok fehérje mérnöki munkát igényel
00:11:40.24 ehhez, és ami igazán izgalmas
00:11:43.16a CRISPR/Cas9 enzimben
00:11:46.11az, hogy ez egy RNS programozott fehérje
00:11:49.25így egyetlen fehérje használható
00:11:52.09a DNS bármely pontján, ahol egy törést szeretnénk létrehozni
00:11:54.27.13egyszerűen megváltoztatva a Cas9-hez kapcsolódó vezető RNS szekvenciáját
00:12:00.24szóval ahelyett, hogy a DNS fehérje alapú felismerésére támaszkodnánk
00:12:03.06a DNS-re támaszkodunk
00:12:06.04A DNS RNS alapú felismerésére
00:12:08.26mint alul látható, tehát ez azt jelenti
00:12:11.03hogy ez csak egy olyan rendszer
00:12:12.18hogy elég egyszerűen használható
00:12:15.15hogy bárki, aki molekuláris biológiai alapképzettséggel rendelkezik
00:12:19.05kihasználhatja ennek a rendszernek az előnyeit
00:12:20.29a genomszerkesztéshez
00:12:22.20és így ez egy olyan eszköz, ami tényleg
00:12:26.06Azt hiszem, kitölti egy lényeges
00:12:29.03és korábban hiányzó komponenst
00:12:30.24a biológia informatikai eszköztárának
00:12:33.29amely nem csak a DNS szekvenálásának és szerkezetének megnézésének képességét tartalmazza
00:12:38.06, a kettős spirálról már az 1950-es évek óta tudunk
00:12:39.24a kettős spirálról
00:12:42.00és az elmúlt évtizedekben
00:12:44.18már lehetővé vált, hogy enzimekkel
00:12:46.09mint a restrikciós enzimek
00:12:47.26és a polimeráz láncreakció
00:12:49.09az egyes szakaszok izolálására és felerősítésére
00:12:52.19a DNS, és most a Cas9
00:12:55.10Egy olyan technológiával rendelkezünk, amely lehetővé teszi
00:12:57.15a genomszerkesztést
00:12:59.13amely a világ minden táján elérhető a laboratóriumokban
00:13:03.07a kísérletekhez, amiket esetleg el akarnak végezni
00:13:05.08és ez a technológia összefoglalása
00:13:10.11a 2-komponensű rendszer
00:13:11.29az RNS-DNS bázispáringra támaszkodik
00:13:14.16a felismeréshez
00:13:15.21és nagyon fontos, mert a módszer
00:13:18.24hogy ez a rendszer működik
00:13:19.28ez tulajdonképpen elég egyszerű
00:13:21.18az úgynevezett multiplexing
00:13:24.20 ami azt jelenti, hogy a Cas9
00:13:27.00több különböző vezető RNS-szel programozhatjuk
00:13:13:28.23egyazon sejtben, hogy többszörös töréseket hozzon létre, és olyan dolgokat tegyen, mint például nagy kromoszómaszakaszok kivágása és egyszerű törlése egyetlen kísérletben.
00:13:38.25És ez egy igazi robbanáshoz vezetett
00:13:42.03a biológia és a genetika területén
00:13:45.19mivel a világ számos laboratóriuma
00:13:48.08átvette ezt a technológiát
00:13:49.25mindenféle nagyon érdekes
00:13:51.15és kreatív alkalmazáshoz
00:13:53.13 és ez a dia
00:13:54.24már majdnem elavult
00:13:56.11de csak hogy érzékeltessem
00:13:57.14hogy ez a terület
00:14:00.07már tényleg beindult
00:14:01.08hogy publikáltuk az eredeti munkánkat a Cas9-ről
00:14:04.10 2012-ben, és addig a pontig
00:14:07.16 nagyon kevés kutatás
00:14:08.18 folyt a CRISPR biológia területén bárhol
00:14:11.12ez egy nagyon kicsi terület volt
00:14:12.19és aztán láthatod, hogy
00:14:13.27 2013-tól kezdve és kiterjesztve
00:14:16.09még most is ez
00:14:17.21hihetetlen robbanásszerűen sok publikáció született
00:14:20.16azokból a laboratóriumokból, amelyek ezt használják
00:14:22.09mint genommérnöki technológiát
00:14:24.01Így számomra
00:14:26.25 alapkutatóként nagyon izgalmas volt látni, hogy ami alapkutatási projektként indult
00:14:29.22, az egy olyan technológiává vált, amelyről kiderült
00:14:34.08, hogy nagyon hasznos lehet mindenféle
00:14:35.28izgalmas kísérleteket
00:14:37.07és csak zárásként szerettem volna megosztani önökkel
00:14:40.07 néhány dolgot
00:14:42.17amelyek ezt a technológiát használják
00:14:44.17így természetesen a bal oldalon
00:14:47.13sok alapbiológia, amit most lehet csinálni
00:14:50.02a modellorganizmusok
00:14:53.03és különböző fajta sejtvonalak
00:14:55.02amelyeket a laboratóriumban tenyésztenek
00:14:56.21a sejtek viselkedésének tanulmányozására
00:14:58.13de a biotechnológiában is, hogy képesek legyünk célzott változtatásokat végezni a növényekben
00:15:05.15és különböző gombákban, amelyek nagyon hasznosak lehetnek
00:15:07.11a különböző ipari alkalmazásokban
00:15:09.29és persze a biomedicinában
00:15:12.14 nagy érdeklődéssel a lehetőség iránt
00:15:14.14, hogy ezt a technológiát eszközként használjuk
00:15:17.03az újszerű terápiák kifejlesztésére
00:15:21.06az emberi betegségekre, azt hiszem, ez valami
00:15:23.09ami nagyon izgalmas és tényleg valami
00:15:26.05ami már a horizonton van
00:15:27.09és aztán ez a dia tényleg csak azt jelzi
00:15:30.20hová fogunk szerintem menni
00:15:33.15 a jövőben sok érdekes
00:15:36.20és kreatív irányba
00:15:39.03amelyek a különböző laboratóriumokban
00:15:41.02mind az akadémiai kutatólaboratóriumokban
00:15:43.19de egyre inkább a kereskedelmi laboratóriumokban
00:15:45.29amelyek lehetővé teszik ennek a
00:15:49.24technológiának a használatát mindenféle alkalmazásban
00:15:52.18melyek közül sokat még két évvel ezelőtt sem tudtunk
00:15:54.10elképzelni.
00:15:56.05Szóval nagyon izgalmas, és csak el szeretném ismerni a nagyszerű csapatot
00:16:01.10 embereknek, akik velem együtt dolgoztak a projekten, és fantasztikus pénzügyi támogatást kaptunk különböző csoportoktól, és öröm volt megosztani ezt önökkel, köszönöm.
00:16:11.00