Frontiers in Oncology

Bevezetés

Tudott, hogy a magas kockázatú humán papillomavírus (hr-HPV) tartós fertőzése a méhnyakrák és a prekancerosus elváltozások egyik szükséges oka (1, 2). Feltárt etiológiával a méhnyakrák nagymértékben megelőzhető (3, 4). A fejlett országokban elkezdték alkalmazni a hr-HPV-vizsgálatot az elsődleges méhnyakrákszűrés során, akár önmagában, akár a citológiával együtt végezve (5-8). Bizonyított, hogy a HPV-alapú szűrőprogramok nagyobb védelmet nyújtanak a méhnyakrák előtti rák és a méhnyakrák ellen, mint más hagyományos szűrési módszerek, például a citológia (9-11). Mivel azonban a legtöbb HPV-fertőzés spontán kiürülhet, a HPV-vizsgálat számos olyan fertőzést azonosít, amelyek nem fejlődnek méhnyakrák előtti rákká vagy rákká, különösen a fiatal nők esetében (12). Ezért a HPV-DNS-vizsgálat nem ajánlott a 30 év alatti nők szűrésére. Ráadásul a későbbi beavatkozásokra utalt HPV-pozitív betegek szükségtelen invazív beavatkozásokat szenvedhetnek el.

Kínában 2015-ben 98 900 új méhnyakrákos eset és 30 500 haláleset volt (13). E rosszindulatú daganatos betegség növekvő tendenciájának megfékezésére a kínai kormány 2009 óta országszerte ingyenes méhnyakrákszűrési programot biztosít a vidéken élő nők számára, a gazdasági és technológiai fejlettségi szintek alapján VIA/VILI, Papanicolaou (Pap) teszt vagy HPV-teszt (kísérleti helyszíneken) segítségével (14). E szűrési módszerek jellegéből adódóan azonban a diagnosztikai pontosságot javítani kell. Továbbá, figyelembe véve Kína nagy népességét, az érzékenység és a specificitás közötti egyensúlyt biztosító új szűrőeszközöket kell értékelni.

A méhnyakrák betegségspecifikus molekuláris markerei a nagy érzékenység és a nagy specificitás kombinációját nyújtják a méhnyakrák pre-rák kimutatására. E markerek többségét a HPV-vel kapcsolatos karcinogenezis mechanizmusa alapján azonosították. A HPV RNS-vizsgálat a HR-HPV E6 és E7 mRNS kimutatásán alapul. A HPV-fertőzés onkogén potenciálja a vírus E6/E7 onkoproteinek termelődésétől függ. Így az E6/E7 mRNS transzkriptumok kimutatása lehetőséget biztosít egy specifikus tesztre a rákot megelőző elváltozások kimutatására.

Ebben a tanulmányban a HPV E6/E7 mRNS teszt klinikai teljesítményét értékeltük a magas fokú méhnyak intraepiteliális neoplázia (CIN) és a rák kimutatására kínai nők körében.

Anyagok és módszerek

Résztvevők és eljárások

Ezt a kórházi alapú vizsgálatot 2017 áprilisa és decembere között végeztük a kínai Henan tartományban. Olyan nőket hívtak meg, akik a The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) nőgyógyászati osztályát keresték fel kolposzkópia céljából. A befogadási kritériumok a következők voltak: (1) 25 és 64 év közötti nők; (2) nem volt méhnyakrák vagy méheltávolítás a kórtörténetben; (3) nem voltak terhesség klinikai tünetei vagy 8 héttel a terhesség megszakítása után; és (4) megértették a vizsgálati eljárásokat, és önkéntesen részt vettek. A vizsgálatot a Henan Cancer Hospital (HCH) intézményi felülvizsgálati bizottsága (IRB) hagyta jóvá. Minden résztvevőtől írásbeli beleegyező nyilatkozatot kaptunk.

A méhnyak hámsejtjeit a nőgyógyászati vizsgálat során nyertük a nőktől. A mintát 20 ml PreservCyt® transzportközegben (Hologic Inc., Marlborough, MA, Egyesült Államok) tartósították és 4°C-on tárolták. Ezután a kolposzkópos vizsgálatot nőgyógyász végezte. A kóros kolposzkópiás lelettel rendelkező nőknél célzott léziós biopsziát végeztek. Ha a kolposzkópos vizsgálat nem volt kielégítő (a squamocolumnáris átmenet nem volt teljesen látható), endocervikális kürettázást (ECC) végeztek. A nyaki hámsejtekből származó mintákat a Kínai Orvostudományi Akadémia Rákkutató Intézetébe és Kórházába (CICAMS) szállították. A mintákat két részre osztották: 1,5 ml sejtkeveréket egy EP-csőbe a HR-HPV DNS-teszthez és a HPV E6/E7 mRNS-teszthez. A maradék konzervcitát hámozott sejtekkel a ThinPrep citológiai teszthez (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, Egyesült Államok) használtuk. A Bethesda jelentési rendszert egy vezető citológus (15) használta a citológiához.

HR-HPV DNS Assay

A 1,5 ml-es EP-csövekből vett 400 μl-es sejtkeverék mintákat 14 hr-HPV típus (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 és 68) DNS-ének kimutatására használták a Cobas 4800 HPV Assay (Roche, Basel, SUI) segítségével. A 14 hrHPV összevont eredményét, valamint a HPV 16 és 18 különálló eredményét egyszerre jelentette (16). A Cobas 4800 a HPV-DNS PCR-alapú vizsgálata volt nukleinsav-hibridizációs amplifikációval a gyártó utasításai szerint. Minden vizsgálatban negatív és pozitív minőségi kontrollt állítottunk be. Ha a ct-érték 40-nél nagyobb volt, az eredményt negatívnak tekintették. Ellenkező esetben az eredmény pozitívnak minősült. A pozitív eredmények három típusba tartoztak: HPV 16, HPV 18 és HPV egyéb (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 és 68).

HPV E6/E7 mRNS vizsgálata

A 14 hr-HPV típusok E6/E7 vírus mRNS-ének kimutatására 1,5 ml-es EP csövekből vett 1 ml-es mintákat használtunk az aggregált APTIMA HPV tesztben (Hologic Inc, Marlborough, MA, Egyesült Államok), a gyártó utasításai szerint (17). A teszt háromlépéses volt, beleértve az mRNS extrakciót, az amplifikációt és az amplifikált termék kimutatását. Ha a kópiaszám nagyobb vagy egyenlő volt, mint 1,0, az eredmény pozitívnak minősült. Ellenkező esetben az eredmény negatív volt.

Hisztopatológiai diagnózis

A biopsziás és ECC-szöveteket a méhnyak intraepiteliális neopláziájának (CIN) jelentési rendszere szerinti szövettani diagnózisok felállítására az SAHZU-ba küldték. Ezután a HCH szövettanárai áttekintették az összes tárgylemezt. Minden ellentmondásos patológiai diagnózist a CICAMS-nak küldtek megítélésre. A végső diagnózis minden egyes nő esetében a testület által végzett felülvizsgálat legrosszabb eredményén alapult. Az összes kimutatási és diagnosztikai folyamat vak volt.

Statisztikai elemzés

A végső szövettani diagnózist használták arany standardként. Azokat a nőket, akiknél a TCT diagnózisa alacsony fokú laphámos intraepiteliális elváltozás (LSIL) vagy rosszabb (LSIL +) volt, folyadékalapú citológia (LBC) pozitívnak minősítették. A HPV-DNS-eredményeket a HPV-típusok szerint rétegeztük: HPV16/18 (azaz HPV16 és/vagy HPV18 pozitív), HPV-más (azaz a HPV16 és HPV18 kivételével a 12 hr-HPV típus bármelyike pozitív) és HPV-összesség (azaz a 14 hr-HPV típus bármelyike pozitív). Kiszámították a pozitív arányok, az érzékenység, a specificitás, a pozitív prediktív érték (PPV) és a negatív prediktív érték (NPV) abszolút becsléseit és 95%-os bizalmas intervallumait (95%CI). A HPV mRNS-expressziójának különbségeit a különböző HPV-csoportokban a chi-négyzet teszt vagy a Fisher-féle egzakt teszt segítségével számoltuk ki. A McNemar-tesztet az érzékenység és a specificitás különbségeinek azonosítására használtuk. Az α-szintet 0,05-ben határoztuk meg, és a p < 0,05 (kétméretű) értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

Az elemzésbe összesen 537 nőt vontunk be. Az átlagéletkor 43,88 ± 10,97 év volt. Az LBC diagnózisok a következők voltak: (34,7%) normális, 135 (25,1%) meghatározatlan jelentőségű atípusos laphámsejt (ASC-US), 22 (4,1%) atípusos laphámsejt nem zárhatja ki a HSIL-t (ASC-H), 7 (1.3%) atípusos mirigysejt (AGC), 82 (15,3%) LSIL, 75 (14,0%) high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL), 31 (5,8%) laphámrák (SCC) és 2 (0,4%) adenocarcinoma in situ (AIS). A szövettani diagnózisok 298 (55,5%) normál, 30 (5,6%) 1-es fokozatú méhnyak intraepiteliális neoplázia (CIN1), 48 (8,9%) CIN2, 111 (20,7%) CIN3, 43 (8,0%) SCC és 7 (1,3%) AIS voltak.

Az 1. táblázat az mRNS és a DNS kimutatása közötti korrelációt mutatja a HPV-típusok szerint. A két teszt teljes egyezése 90,7% (95%CI: 87,9, 92,9) volt, 0,81-es kappa értékkel. Az mRNS pozitív aránya 91,7%, 84,6% és 86,4% volt a HPV16/18, HPV-más, illetve HPV-összességében pozitív nők esetében. Az összes mRNS-pozitív arány magasabb volt a HPV-pozitív nőknél, mint a HPV-negatív nőknél az azonos HPV-típusú csoportban (mindegyik p < 0,001).

A HPV-DNS-, mRNS- és LBC-pozitív arányok a szövettani diagnózis súlyosságával nőttek, a normál állapotúak 25,5, 19,1, illetve 11,4%-tól az SCC 100,0%-ig terjedtek. A három teszt pozitív aránya AIS-ben 85,7, 85,7, illetve 100,0% volt. E három teszt hasonló pozitív arányt mutatott CIN3, SCC és AIS esetén. Az mRNS pozitív aránya azonban viszonylag alacsonyabb volt a CIN2 diagnózis alatt álló nőknél. A HPV16 pozitív arányok a CIN3, az SCC és az AIS esetében voltak a legmagasabbak a többi HPV-DNS-csoporttal összehasonlítva. A HPV18 pozitív arányok 7%-nál alacsonyabbak voltak az összes laphámsejtes elváltozásban, de valamivel magasabbak (28,6%) az AIS-ben (2. táblázat).

A 3. táblázat a három teszt klinikai teljesítményét mutatja a CIN2+ és CIN3+ elváltozások kimutatásában. Az mRNS érzékenysége a CIN2+ és a CIN3+ kimutatására 93,8% (95%CI: 89,7-96,4), illetve 95,7% (95%CI: 91,3-97,9) volt, ami nem különbözött a DNS-sel kimutatott értékektől (95,7% a CIN2+ esetében, 96,3% a CIN3+ esetében), de magasabb volt, mint az LBC-vel kimutatott értékek (80,4% a CIN2+ és 88,8% a CIN3+ esetében). Az mRNS specificitása a CIN2+ (79,0% ) és a CIN3+ (70,5% ) kimutatására szignifikánsan magasabb volt, mint a DNS által kimutatottak (71,0% a CIN2+ esetében, 62,8% a CIN3+ esetében) (p < 0,05), de alacsonyabb, mint az LBC-vel kimutatottak (84,5% a CIN2+ esetében, 79,8% a CIN3+ esetében). Az mRNS PPV értéke a CIN2+ és a CIN3+ kimutatására 74,0% (95%CI: 68,4-78,9) és 58,1% (95%CI: 52,1-63,9), az NPV pedig 95,2% (95%CI: 92,0-97,2), illetve 97,4% (95%CI: 94,8-98,8) volt.

A 4. és 5. táblázat a három teszt pozitív arányát és klinikai teljesítményét mutatja a különböző korcsoportokban. Összefoglalva, valamennyi teszt jobb teljesítményt mutatott a 30 évnél idősebb nők esetében, mint a fiatalabbaknál. A HPV-DNS-tesztnek volt a legnagyobb érzékenysége, az LBC-nek pedig a legnagyobb specificitása a CIN2+ és CIN3+ kimutatására a 30 évnél fiatalabb nőknél.

Diszkusszió

A bemutatott eredmények azt mutatták, hogy az mRNS-teszt és a DNS-teszt magas, 90,7%-os egyezést ért el. A HPV-DNS-, mRNS- és LBC-pozitív arányok a szövettani diagnózis súlyosságával együtt nőttek, a normál esetben 25,5, 19,1, illetve 11,4%-ról az SCC-ben 100,0%-ra. Az mRNS érzékenysége a CIN2 és CIN3+ kimutatására 93,8% és 95,7% volt, ami hasonló volt a DNS-sel kimutatott értékekhez (95,7% a CIN2+ esetében és 96,3% a CIN3+ esetében). Az mRNS specificitása (79,0% a CIN2+ és 70,5% a CIN3+ esetében) azonban jelentősen magasabb volt, mint a DNS-sel kimutatottaké (71,0% a CIN2+ és 62,8% a CIN3+ esetében).

Ebben a vizsgálatban a HPV E6/E7 mRNS teszt és a HPV DNS teszt nagyfokú egyezést mutatott. A HPV 16/18 DNS-pozitív nők 91,7%-a volt pozitív az mRNS-teszten is, ami hasonló más tanulmányokhoz, amelyek az APTIMA HPV-teszt és a HPV DNS-tesztek közötti 90% feletti általános egyezésről számoltak be (17, 18), és a HPV DNS-teszt következetesen magasabb pozitív arányáról számoltak be különböző populációkban (19, 20). Az idősebb nőknél magasabb pozitív arányt észleltünk, mint a fiatalabbaknál, ami némileg eltér más tanulmányoktól (21-23). Ez az eltérés a vizsgálati tervnek (azaz a kórházi vizsgálatnak) tulajdonítható, ami korlátozza az eredmények általános populációra való extrapolálását. Érdekes módon a diszkordáns arány magasabb volt a 30 éves vagy annál fiatalabb nők körében (25,6% vs. 8,6%). Tanulmányok kimutatták a HPV-fertőzés spontán kiürülésének magasabb arányát a fiatalabb nőknél, ami a HPV-integráció kisebb lehetőségére utal (24).

Mint tudjuk, a DNS-alapú HPV-tesztek a HPV-DNS jelenlétét vagy hiányát mutatják ki. A legtöbb HPV-fertőzés azonban átmeneti, 1 éven belül spontán kiürül, ami nem fejlődik méhnyakrák előtti vagy rákos megbetegedéssé (25). Az E6/E7 mRNS-expresszió csak az aktívan fertőzött sejtekben fordul elő, és a CIN kialakulása és progressziója során növekszik (26). Ezért a HPV mRNS-teszt feltételezhetően specifikusabb a magas fokú méhnyakelváltozások kimutatásában. Adataink megerősítették ezt a hipotézist. Azt találtuk, hogy az mRNS-teszt ugyanolyan érzékeny, mint a DNS-teszt, de specifikusabb volt a méhnyakrák előtti és a rák kimutatásában. Más kutatók hasonló következtetéseket vontak le akár az elsődleges szűrés (20), akár a kisebb rendellenes citológiával rendelkező nők triázsvizsgálata során (27). Vizsgálatunkban 50 nő esetében a HPV-DNS- és az mRNS-teszt eredményei nem egyeztek. Közülük 34 DNS + /mRNS- versus 8 mRNS + /DNS- normál vagy CIN1; 6 versus 2 CIN2 vagy CIN3 diagnózist kapott; a rákos megbetegedésekben nem figyeltek meg tesztkülönbséget. Ha tehát a HPV-DNS-tesztet mRNS-teszttel helyettesítjük, 34 nőt nem utalnánk szükségtelen kolposzkópiára, de 4 CIN2 és 2 CIN3 elmaradna. A 6 hiányzó eset ellenére nem veszett el az érzékenység, de a specificitás nőtt. A szakirodalom szerint a CIN2-es esetek 40-60%-a 2 éven belül visszafejlődik (28, 29), és nem minden CIN3-as eset valódi rák előtti elváltozás (30). Cook és munkatársai szintén alacsony CIN2+ arányt találtak az mRNS-/DNS+ nők körében (17). Ezért a 6 nő esetében az invazív rák kockázata rövid időintervallumban alacsony volt.

A teszt teljesítményét idősebb és fiatalabb nők esetében is értékeltük. Az életkor-specifikus elemzés azt találta, hogy a három teszt jobban működött a 30 évnél idősebb nőknél. Abból kiindulva, hogy a fiatalabb, CIN-elváltozással rendelkező nőknél nagyobb volt a regresszió lehetősége, a fiatalabb nők konzervatív kezelését javasoljuk. A vizsgálatok szerint a HPV-fertőzés gyakori volt a fiatal nőknél, azonban nagy részük átmeneti fertőzés volt, és spontán kiürülhetett (31, 32). A legtöbb HPV-fertőzés rövid időtartama ezeknél a nőknél arra utal, hogy a társuló méhnyakdiszpláziát konzervatív módon kell kezelni (12). Ezért a HPV-DNS-teszt a magas álpozitív arány miatt nem biztos, hogy megfelelő szűrési módszer a 30 év alatti nők esetében. A citológia és az E6/E7 mRNS átfogó szűrési teljesítményét fiatal nőknél értékelni kell. Vizsgálatunk adatai azt mutatták, hogy a citológia a legmagasabb specificitással rendelkezik a 30 év alatti nőknél, de az érzékenység alacsonyabb, mint a HPV-DNS-teszté. Az E6/E7 mRNS esetében azonban a 30 évnél fiatalabb nőknél mérsékelt teljesítményt mutatott, amely a citológiánál nagyobb érzékenységgel és a HPV DNS-nél nagyobb specificitással járt, ami arra utal, hogy az E6/E7 mRNS vizsgálat ígéretes lehetőség lehet a 30 év alatti nők szűrésére.

Noha a kínai élelmiszer- és gyógyszerhatóság három profilaktikus HPV-vakcinát (Cervarix, Gardasil és Cecolin) engedélyezett, a méhnyakrák megelőzése továbbra is a szűrésen alapul. A kínai kormány 2009-ben országszerte ingyenes méhnyakrákszűrést indított a vidéki nők számára. A HPV-DNS-tesztet 2015-ben alkalmazták először kísérleti helyszíneken elsődleges szűrőeszközként. A nagy népességszám miatt azonban a HPV-DNS-alapú szűrés elkerülhetetlenül nagyszámú hamis pozitív eredményt eredményezne, ami az egészségügyi erőforrások pazarlásához és felesleges aggodalomhoz vezetne. Ígéretes, hogy az mRNS-t a nemzeti méhnyakrákszűrési programban lehetne használni a hamis pozitívumok csökkentése érdekében anélkül, hogy az érzékenység csökkenne.

Ebben a tanulmányban több korlátozást is figyelembe kell venni. Először is, ez egy keresztmetszeti vizsgálat, és nem tudtuk értékelni a HPV E6/E7 mRNS-hez kapcsolódó lézió progressziójának kockázatát. Adatainkat azonban szövettani fokozat szerint rétegeztük, ami információt nyújt az összefüggésről. Másodszor, fontos megjegyezni, hogy az eredmények nem általánosíthatók teljes mértékben az általános populációra, mivel a vizsgálat résztvevőit a kórházi járóbeteg-ellátásból toboroztuk.

Összefoglalva, az APTIMA mRNS-teszt jó egyezést mutatott a Cobas 4800 HPV DNS-teszttel, hasonló érzékenységgel és magasabb specificitással a magas fokú méhnyakléziók kimutatására. Ígéretes, hogy az mRNS-t a kínai nemzeti méhnyakrákszűrési programban az érzékenység elvesztése nélkül lehetne használni a hamis pozitívumok csökkentése érdekében. További vizsgálatokra van szükség az mRNS-teszt klinikai teljesítményének értékeléséhez fiatalabb kínai nőknél.

Adatok hozzáférhetőségi nyilatkozata

A tanulmányhoz létrehozott összes adatkészletet a cikk/kiegészítő anyag tartalmazza.

Etikai nyilatkozat

A humán résztvevőkkel végzett vizsgálatokat a HPV E6/E7 mRNS és a p16/Ki-67 fehérje együttes expressziójának szerepe a méhnyakrák kockázatának előrejelzésében felülvizsgálta és jóváhagyta. A Zhengzhou Egyetem élettudományi etikai felülvizsgálati bizottsága által. A betegek/résztvevők írásbeli tájékozott beleegyezésüket adták a vizsgálatban való részvételhez.

A szerzők hozzájárulása

S-KZ hozzájárult a tervezéshez és írta a kéziratot. ZG hozzájárult a kézirat megírásához és átdolgozásához. PW, M-MJ és P-PG hozzájárult a vizsgálathoz és a HPV DNS-teszthez. L-NK és Z-NW hozzájárult a HPV mRNS vizsgálathoz. D-MZ hozzájárult a citológiai és szövettani vizsgálathoz. QC és X-QC végezte a statisztikai elemzést. X-BS segített a tanulmány kidolgozásában és a statisztikai elemzésekben. Y-LQ és J-GZ segítettek a tanulmány kidolgozásában és a kézirat megírásában. J-GZ segített a vizsgálat végrehajtásában. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Finanszírozás

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (Grant No. 81502475) és Henan tartomány tudományos és technológiai projektje (Grant No. 172102310067) támogatta.

Érdekütközés

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségként értelmezhetők.

Köszönet

A tanulmányban részt vevő valamennyi nőnek köszönjük a részvételt. Nagyra értékeljük továbbá az összes érintett orvos hozzájárulását ehhez a tanulmányhoz, valamint a Nemzeti Rákközpont, a Rákkórház, a Kínai Orvosi Tudományos Akadémia és a Pekingi Unió Orvosi Főiskola segítségét. Nagyra értékeltük továbbá a 32. Nemzetközi Papillomavírus Konferenciát (IPVC 2018), amiért platformot biztosított a tanulmány absztraktjának bemutatására (cím: A HPV E6/E7 mRNS teszt klinikai teljesítménye a méhnyak magas fokú intraepiteliális neoplázia és rák kimutatására: A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session).

A rövidítések

hr-HPV, magas kockázatú humán papillomavírus; VIA/VILI, vizuális vizsgálat ecetsavval/látványos vizsgálat Lugol jódoldattal; Pap, papanicolaou; SAHZU, Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95%CI, 95%-os bizalmas intervallum; ECC, endocervical curettage; TCT, ThinPrep citológiai vizsgálat; CIN, méhnyak intraepiteliális neoplázia; LSIL, alacsony fokú laphámos intraepiteliális elváltozás; HSIL, magas fokú laphámos intraepiteliális elváltozás; LBC, folyadék alapú citológia; PPV, pozitív prediktív érték; NPV, negatív prediktív érték; ASC-US, meghatározatlan jelentőségű atípusos laphámsejtek; ASC-H, atípusos laphámsejt nem zárja ki a HSIL-t; AGC, atípusos mirigysejt; SCC, laphámsejtes karcinóma; AIS, adenokarcinóma in situ.