Differenciális hatások humán keratinocita sejtek membránpermeabilitására és életképességére nagyon alacsony intenzitású megaszónikus mezők hatására

A HaCaT sejteken vizsgálták az 1 MHz-es frekvenciájú, nagyon alacsony intenzitású USA (Ispta 7 és 16 mW/cm2 között, jóval a kavitációs küszöbérték, 100 mW/cm2 alatt) hatását. A kísérleteket az ESI S1 ábráján vázolt egyenértékű orvosi elrendezéssel végeztük, változó kezelési paraméterek, például Ispta, munkakapcsolat és szonikációs idő mellett. Az előzetes kísérletek rámutattak arra, hogy az itt érintett expozíciós paraméterek tartományában a hőmérséklet állandó maradt (1 °C-on belül), kizárva az amerikai energia hődisszipációját. Ezenkívül a kezelések nem mutattak szignifikáns függést a vizsgált hatásoknak az US-hullám ciklusától. Ezek a megfigyelések összhangban vannak az alacsony US-abszorpcióval 1 MHz-en; ezzel szemben a hőhatások és a munkaciklus hatással lehet a magasabb frekvenciáknak kitett sejtekre és szövetekre, mivel az US-csillapítási együttható a frekvenciával arányos23,31.

Az eredményeket először a két releváns expozíciós paramétert, a szonikációs időt és az Ispta-t külön-külön figyelembe véve mutatjuk be. A sejtmembrán szerkezeti és fizikai változásait (permeabilitás, felvételi hatékonyság és az internalizált molekulák maximális mérete) elemezzük, és összefüggésbe hozzuk a megfelelő citotoxikus károsodással és a gyulladásos minták lehetséges aktiválásával. Ezt követően az eredményeket a szonikációs dózis szempontjából értelmezzük, amelyet az Ispta és az expozíciós idő szorzataként határozunk meg, azaz a szonikáció során a mintára beeső akusztikus energia felületi sűrűsége alapján. Valójában a vizsgált jelenségek ettől a mennyiségtől függenek, és ez lehetővé tette számunkra, hogy meghatározzuk az expozíciós paraméterek azon tartományát, ahol elhanyagolható biológiai károsodással átmeneti SP lép fel.

Az US expozíciós idő hatásának elemzése

A HaCaT sejtek membránpermeabilitásának alacsony intenzitású, 1 MHz-es US által kiváltott változásait a zöld fluoreszcens szonda, a calcein felvételének hatékonysága alapján becsültük. Mivel az ép membránok a kalcein számára átjárhatatlanok, a kalcein megbízható marker az SP számára. A zöld-pozitív sejtek százalékos arányát a 2.5. szakasz szerinti áramlási citometriai elemzésekkel számszerűsítettük.

A membránpermeabilitás US-expozíciós időre való érzékenységének értékeléséhez nagyon alacsony US Ispta-t használtunk. Figyelemre méltó, hogy már 7 ± 1 mW/cm2 Ispta esetén is jelentős hatást lehet kiváltani a membránpermeabilitásra a megfelelő expozíciós idővel. A HaCaT és NIH-3T3 sejteken végzett párhuzamos áramlási citometriai vizsgálat reprezentatív eredményei, amelyeket 5′, 15′, 30′ és 45′ Ispta ~7 mW/cm2 mellett szonikáztunk, az 1. ábrán láthatóak (piros háromszögek és kék négyzetek). Ahogyan az várható volt, a sejtvonalak összehasonlítása alacsony szonikációs idők után (a szonoporációs küszöbérték alatt) a kalcein kis affinitását eredményezi, ahol a különbségek (a HaCaT sejteknél a legnagyobbak) a membrán összetételének és permeabilitásának sajátosságait kell, hogy magyarázzák. Ennél is fontosabb, hogy mindkét sejtvonal a felvételi hatékonyság jelentős növekedését mutatja 15′ expozíciótól kezdődően, ami (6,3 ± 0,9) J/cm2 szonikációs dózisnak felel meg, ami az SP folyamat aktiválódására utal. Az 1. ábra legjobb illesztései szerint hosszabb expozíciós idő esetén kísérleteink lineáris korrelációt mutatnak a felvételi hatékonyság és az expozíciós idő között, az US által indukált felvételi sebesség azonos a HaCaT és az NIH-3T3 sejtekben (lineáris regressziós meredekség (%/min) 1,3 ± 0,2, illetve 1,4 ± 0,2 a HaCaT és az NIH-3T3 esetében). Ez azt jelentené, hogy az SP hatására bekövetkező felvételhatékonyság-növekedés sejtvonal-független jelenség.

Az SP folyamat további vizsgálatához és az internalizáció jellemzéséhez a kezelt HaCaT sejteket fluoreszcens mikroszkópiával értékeltük. Az áramlási citometriai eredményekkel összhangban az 5′ hosszan szonikázott minták nem mutatnak jelentős változást a membránpermeabilitásban a kontroll (kezeletlen) mintához képest, míg 15′-től kezdődően növekvő felvételi hatékonyság figyelhető meg (amint azt a 2. ábra és az ESI S2. ábrája mutatja), bár nem minden sejt mutatott fluoreszcenciát. Ennek megfelelően a sejtek kevésbé tűnnek sűrűnek és tapadónak a kontrollmintához képest, ami a szoros kötések lazulására utal. A 2. ábra reprezentatív képei a kalcein heterogén lokalizációjára utalnak a sejteken belül, és valójában a konfokális fluoreszcens mikroszkópia lehetővé tette, hogy a HaCaT sejteken belül egyértelműen megkülönböztessük a szonda perifériás eloszlását a belső eloszlástól (lásd a 3. ábra képét és 3D rekonstrukcióit). További részletes képek az ESI 3. szakaszában láthatók. A megfigyelések összhangban vannak a fluorszonda kétszintű felvételével: a perifériás, ahol a szonda az endoplazmatikus retikulum hálózatában lokalizálódik a plazmamembrán körül; a másik, 30′ expozíció után jelentősen megmutatkozó, ahol a szonda citoplazmába való diffúziója intenzív fluoreszcenciát okoz, amely egyenletesen oszlik el az egész sejtben, beleértve a nukleoplazmát is. Meg kell jegyezni, hogy a kalcein Stokes-átmérője ~1,36 nm, és intranukleáris transzportját nem akadályozzák diffúziós akadályok29. A 3.2. és 3.3. szakaszban közölt teljesebb elemzés arra enged következtetni, hogy az US-expozíció dózisa és a szonda molekulatömege domináns tényezők voltak a felvétel meghatározásában.

Egy további, vörös PI fluorszondán alapuló vizsgálatot végeztünk a szonikázott sejtek natív membránpermeabilitásának helyreállítása érdekében (lásd még a 2.3. szakaszt). A PI internalizációja a citotoxikus folyamatok aktiválódását jelzi. A zöld és a vörös festék együttes lokalizációja a sejtek belsejében tehát a membrán helyreállítási folyamatának kudarcát jelzi az SP után. Másrészt a sejtekben a zöld fluoreszcencia megfigyelése a piros hiányában a membrán SP előfordulására utal az amerikai kezelés során és annak sikeres helyreállítására a mező kikapcsolása után. A reprezentatív konfokális fluoreszcencia felvételeket a 4. ábra mutatja. A két festék ko-lokalizációja a 15′ ideig kezelt sejtekben hiányzik, míg 30′ expozíció után alig figyelhető meg (ESI S5. ábra). Következésképpen ~5%-os nettó életképesség-veszteséget mutattunk ki, amit áramlási citometriával ellenőriztünk. A 45′ ideig szonikázott sejtekben, ami (19 ± 3) J/cm2 dózisnak felel meg, a ko-lokalizáció sokkal szembetűnőbb (lásd a 4B. ábra fehér nyilait), és az életképesség még jelentősebb (~10%-os, áramlási citometriával ellenőrzött) csökkenése következik be. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hosszabb expozíciós idő, amely nagyobb dózisnak felel meg rögzített Ispta mellett, irreverzibilis változást idéz elő a membránszerkezetben, amelyet következetes citotoxikus válasz követ.

Az US intenzitás hatásának elemzése

Az alkalmazott US-mező intenzitásának változtatásának hatását a membránpermeabilitásra HaCaT sejtvonalon elemeztük 15′ expozíció után, ami elég rövid ahhoz, hogy kizárjuk a hosszan tartó szonikáció által kiváltott hatásokat. Vizsgálatunkban az US-intenzitások az Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 és az Ispta = (16 ± 1) mW/cm2 közötti tartományban voltak, jóval a kavitációs küszöbérték24 alatt. A 2.3. és 2.5. szakaszban leírt protokoll szerint különböző MW-értékű (MW = 10, 40 és 70 kDa) FITC-jelölt dextránt használtunk, hogy az egyes US-intenzitások esetében jellemezzük a membránpermeabilitás indukcióját a különböző molekulatömegek számára. Ez az eljárás viszont lehetővé teszi a szonopórus méretének értékelését. A kalceinhez hasonlóan a dextránsok nem jutnak be jelentősen a kezeletlen sejtekbe31,32, míg kavitációs US-rendszerben a FITC-jelölt dextránsok sejtfelvétele mind az SP, mind az endoszóma-transzport elősegítése révén erősen fokozható30. Ebben a tekintetben az 5. ábrán közölt áramlási citometriai mérési eredmények egyértelműen méretfüggő felvételt mutatnak, amely jelenség lehetővé teszi számunkra, hogy kizárjuk az aktív endocitózishatások egyidejűségét, és az irodalom22 szerint az alacsony intenzitással kiváltott SP-re utal, mint a dextránmolekulák plazmamembránon keresztüli transzportjában részt vevő fő mechanizmusra. Konkrétan, a megfigyelt SP-indukált felvételt egy Ispta küszöbérték jellemzi, amely lineárisan növekszik az internalizált molekulák MW-értékének növekedésével. E küszöbérték alatt a kezelt sejtek felvételi hatékonysága hasonló a nem exponált sejtekéhez. Az Ispta küszöbértékeket az 1. táblázat tartalmazza. A küszöbérték feletti intenzitások esetén a felvételi hatékonyság az Ispta növekedésével növekszik, amíg el nem éri a maximumot. A 10 kDa dextrán esetében ezután enyhén csökken egy platóig. A felvételi hatékonyság nagy intenzitásoknál megfigyelt csökkenése az elhalt sejtek számának növekedésével magyarázható, amelyek az öblítés során eltávolításra kerülnek a mintából, és így nem járulnak hozzá az áramlási citometriai elemzésekhez. Továbbá az apoptotikus folyamatok aktiválódása akadályozhatja a festék internalizációját. Figyelemre méltó, hogy Ispta = 15 mW/cm2 esetén, bár ez az érték jóval alacsonyabb, mint a kavitációs küszöbérték, a sejtek képesek internalizálni a 70 kDa dextránt, amelynek Stokes-átmérője ~12 nm. Ez az érték a membránban keletkező szonopórusok minimális méretére vonatkozó becslésnek tekinthető. Az S6. ábrán (az ESI 4. szakasza) reprezentatív fluoreszcenciaképeket közlünk, amelyek a dextráns felvételét mutatják az Ispta küszöbértéknél a PI-teszttel együtt.

A PI internalizációja jelentős citotoxikus választ mutat Ispta = 15 mW/cm2 (13,5 J/cm2 expozíciós dózis) esetén. Amint arról Udroiu és munkatársai13 hasonló kísérleti körülmények között beszámoltak, NIH-3T3 sejtekben is megfigyelték a mikronukleuszok előfordulásának enyhe, de szignifikáns növekedését, az 1 MHz-es US expozíció intenzitásától és idejétől függően. Ezek a megfigyelések azt sugallták, hogy további vizsgálatokra van szükség a membrán SP-t kísérő biológiai hatások jobb megértéséhez, ezért a szonikázott sejtek biológiai válaszának vizsgálatát végezték el az US intenzitás függvényében.

A nagyon alacsony US intenzitások által kiváltott SP által kiváltott “membránsebekre” adott biológiai választ alaposan jellemezték a sejthalál értékelésével, a 2.5. szakaszban leírt kombinált AnnexinV és PI teszt segítségével (lásd még az ESI 5. szakaszát). Értékeltük az IL-6 gén expresszióját is, amely egy olyan citokin, amely a krónikus gyulladást a rákhoz köti33,34. Az áramlási citometriai elemzés eredményeit, a sejtek százalékos arányában kifejezve, a 6. ábra mutatja be. A sejtek életképessége nagyrészt megmarad (>90%) a 15′-es kezelések során, mindazonáltal Ispta = 9 mW/cm2 -től kezdve enyhe csökkenés következik be, a korai apoptotikus sejtek számának növekedésével együtt. Ispta = 14 mW/cm2-nél a nekrotikus sejtek jelentős aránya kezd megfigyelhetővé válni, míg Ispta = 16 mW/cm2-nél a késői apoptózis is hozzájárul a sejthalálhoz, a nekrózis enyhe csökkenésének megfelelően (reprezentatív áramlási citometriai diagramok az ESI S7 ábráján). Az IL-6 génexpressziót RT-PCR segítségével határoztuk meg (7. ábra). Az Ispta ≤15 mW/cm2 esetében nem figyeltünk meg up-regulációt, míg a 16 mW/cm2-es kezelés a kezeletlen sejtekhez képest e gén overexpresszióját idézte elő.

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy 16 mW/cm2 Ispta küszöbértéktől és 15′ szonikációtól kezdve az US által okozott membránkárosodás nemcsak a sejtek életképességét csökkenti, hanem a gyulladással kapcsolatos IL-6 gén túlterjedésén keresztül gyulladásos választ is kiválthat. Mivel számos kutatás felismerte a gyulladás szerepét a betegségek, például a rák35,36 patogenezisének és progressziójának elősegítésében, további vizsgálatokra van szükség a gyulladásos mintákhoz kapcsolódó szempontok jobb jellemzésére.

A szonikációs dózis hatásának elemzése

Az alkalmazott amerikai mező és a megfigyelt biológiai hatások közötti kapcsolat kvantitatív elemzése érdekében a sejteknek az expozíció során átadott energia szempontjából a szonikációs dózist minden egyes kezelésnél az Ispta intenzitás és az expozíciós idő szorzataként számoltuk ki. A kapott értékeket a 2. táblázat tartalmazza, ahol a megfigyelt biológiai hatásokat háttérszínnel jelöltük. Eredményeink arra utalnak, hogy a membrán SP körülbelül 6,3 J/cm2 küszöbdózistól kezdődően következik be. Továbbá a szonopórusok mérete összefüggésbe hozható a szonikációs dózissal. A 10,8 J/cm2-nél nagyobb dózisok esetén a kezelt sejtekben az életképesség csökkenése és a korai apoptózis kísérő eseményei figyelhetők meg, majd 14,4 J/cm2-től kezdődően késői apoptózis, nekrózis és az IL-6 túlexpressziója következik be.

Kihangsúlyozzuk, hogy ez a dózis és az Ispta 16 mW/cm2 ~0,02 MPa negatív csúcsnyomásnak felel meg. Ez az érték elég magasnak tűnik ahhoz, hogy mechanikai feszültséget idézzen elő a plazmamembrán/víz határfelületen, bár egy nagyságrenddel alacsonyabb, mint az eddig javasolt biztonsági expozíciós küszöbérték (mechanikai index ~0,2-0,3, 1 MHz-en).

Megjegyezzük, hogy kísérleteinket sikeresen összehasonlítottuk az amerikai terápiában ténylegesen alkalmazott elektromedikai rendszer alkalmazásával végzett kísérletekkel (lásd még a 2.2. szakaszt), ezzel is kiemelve megközelítésünk orvosi jelentőségét. Ebben a tekintetben biztosak vagyunk abban, hogy a szonikációs dózisra vonatkozó információk megadása (a rögzített US-frekvencia mellett) lehetővé teszi az US-expozícióra adott sejtválasz jellemzésének teljesebb indexét, és viszont a paraméterek olyan tartományának finom azonosítását, ahol az átmeneti SP elhanyagolható biológiai károkkal fordul elő.

Eredményeink in vivo biológiai hatásának megértéséhez nagyon fontos lépés lenne az US-expozíciót háromdimenziós biorendszereken, például többrétegű keratinocitákból vagy a vér-agy gát endotélsejtjeiből álló emberi szöveteken működtetni.