Az enzimek egyik tulajdonsága, amely diagnosztikai és kutatási eszközként olyan fontossá teszi őket, az a specifitás, amelyet az általuk katalizált reakciókhoz képest mutatnak. Néhány enzim abszolút specifitással rendelkezik, azaz csak egy adott reakciót katalizál. Más enzimek egy bizonyos típusú kémiai kötésre vagy funkcionális csoportra specifikusak. Általánosságban négyféle specifitás különböztethető meg:
- Abszolút specifitás – az enzim csak egy reakciót katalizál.
- Csoportspecificitás – az enzim csak olyan molekulákra hat, amelyek meghatározott funkciós csoportokkal rendelkeznek, például amino-, foszfát- és metilcsoportokkal.
- Kapcsolati specifitás – az enzim egy adott típusú kémiai kötésre hat, függetlenül a molekulaszerkezet többi részétől.
- Sztereokémiai specifitás – az enzim egy adott sztérikus vagy optikai izomerre hat.
Noha az enzimek nagyfokú specifitást mutatnak, a kofaktorok számos apoenzimet szolgálhatnak. Például a nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) számos olyan dehidrogenáz reakció koenzimje, amelyben hidrogénakceptorként működik. Ezek közé tartozik az alkohol-dehidrogenáz, a malát-dehidrogenáz és a laktát-dehidrogenáz reakciók.