A magzatvíz és a magzatmembrán őssejtjei: Marker Discovery

Abstract

A magzatvíz (AF) és az amnionmembrán (AM) a közelmúltban őssejtek vagy progenitor sejtek ígéretes forrásaként jellemezték. Mindkettő nemcsak a felnőtt őssejtekhez hasonló őssejtjellemzőkkel rendelkező alpopulációkat tartalmaz, mint például a mesenchymális őssejtek, hanem bizonyos embrionális őssejt tulajdonságokkal is rendelkeznek, mint például (i) pluripotencia markerek kifejeződése, (ii) nagyfokú in vitro expanzió, vagy (iii) multilineáris differenciálódási képesség. A közelmúlt erőfeszítései ezen őssejttípusok izolálására és részletes jellemzésére összpontosítottak. A fenotípusukban mutatkozó eltérések, a különböző csoportok által leírt heterogenitásuk és a csak ezekben a sejtekben kifejeződő egyetlen marker hiánya azonban megakadályozhatja egy tiszta, homogén őssejtpopuláció izolálását ezekből a forrásokból és e sejtek potenciális felhasználását terápiás alkalmazásokban. Ebben a tanulmányban célunk, hogy összefoglaljuk a magzati forrásokból, például AF-ből és AM-ből származó őssejtek markereinek felfedezése terén a közelmúltban elért eredményeket, transzkriptomikai, proteomikai vagy szekretomikai elemzéseken alapuló új módszertanok alkalmazásával.

1. Bevezetés

A magzatvíz (AF) és az amnionmembrán (AM) egyaránt gazdag őssejtforrást jelent, amely a jövőben klinikai terápiás alkalmazásokban használható. Az őssejtek e forrásokból történő izolálásával kapcsolatos etikai aggályok minimálisak , ellentétben a humán embrionális őssejt (ESC) kutatás során felmerülő kérdésekkel. Az AF-et a terhesség 15. és 19. hete közötti tervezett amniocentézis során gyűjtik a prenatális diagnózis céljából, és a felesleges minta felhasználható a sejtek kinyerésére , míg az AM-et általában a terminális terhességek császármetszése során gyűjtik. Tekintettel az ezekből a forrásokból származó őssejtpopulációk heterogenitására, a specifikus sejttípusok izolálása nehéz, és az adott sejtek részletes fenotípusos és molekuláris jellemzését igényli. Az omikai megközelítéseket is tartalmazó vizsgálatok alapvető fontosságúak e sejtek molekuláris kifejeződési mechanizmusainak jobb megértésében és az izolálásuk helyes módszertanának meghatározásában, mielőtt terápiás megközelítésekben használnák őket.

Ez a cikk célja, hogy bemutassa az AF- és AM-eredetű őssejtek főbb biológiai és molekuláris jellemzőit, valamint rávilágítson a markerek felfedezésében globális módszerekkel, például transzkriptomikai, proteomikai vagy szekretomikai elemzésekkel elért legújabb eredményekre.

1.1. Az őssejtek biológiai és molekuláris jellemzői. Magzatvíz

AzAF védőfolyadékként szolgál a fejlődő embrió számára, mechanikai támaszt és a szükséges tápanyagokat biztosítja az embriogenezis során . Az amniocentézist évtizedek óta rutineljárásként alkalmazzák a magzati kariotipizálás és a prenatális diagnosztika során, lehetővé téve számos genetikai betegség kimutatását .

Az AF fő összetevője a víz; általános összetétele azonban a terhesség során változik. A terhesség kezdetén a magzatvíz ozmolaritása hasonló a magzati plazmáéhoz. A magzati bőr keratinizációja után a magzatvíz ozmolaritása az anyai vagy magzati plazmához képest csökken, főként a magzati vizelet beáramlása miatt . Még érdekesebb, hogy az AF a magzatból vagy a környező magzatburokból származó őssejtpopuláció gazdag forrását is jelenti . A közelmúltban több csoport további vizsgálatai a magzatvízből származó sejtek sejtszintű tulajdonságaira és a preklinikai modellekben és a transzplantációs terápiákban való lehetséges felhasználásukra összpontosítottak .

1.1.1. Magzatvíz őssejtek (AFSCs)

A magzatvíz sejtek (AFCs) a három csírarétegből származó heterogén populációt képviselnek. Ezek a sejtek közös hám eredetűek, és vagy a fejlődő embrióból, vagy a magzatmembrán belső felszínéről származnak, amelyeket magzatmembrán őssejtekként jellemeznek . Az AFC-k főként a tapadó sejtek három csoportjából állnak, amelyeket morfológiai, növekedési és biokémiai jellemzőik alapján kategorizálnak . Az epithelioid (E-típusú) sejtek a magzati bőrből és vizeletből származó kuboid vagy oszlopos sejtek, a magzatvíz (AF-típusú) sejtek a magzati membránból származnak, a fibroblasztikus (F-típusú) sejtek pedig főként a rostos kötőszövetből keletkeznek. Mind az AF-, mind az F-típusú sejtek fibroblastoid morfológiával rendelkeznek, és úgy tűnik, hogy a domináns sejttípus az AF-típusú, amely keratinokat és vimentineket koexprimál . Számos tanulmány dokumentálta, hogy az emberi magzatvíz őssejtjei (AFSC) könnyen kinyerhetők a második trimeszteri AF kis mennyiségéből, amelyet a rutinszerű magzatvízvizsgálat során gyűjtöttek , egy olyan eljárás során, amelynek spontán vetélési aránya 0,06-0,5% között mozog . A mai napig számos különböző tenyésztési protokollról számoltak be, amelyek dúsított őssejtpopulációkat eredményeztek. Az AFSC izolálását és a megfelelő tenyésztési protokollokat Klemmt és munkatársai egy nemrégiben megjelent áttekintésben foglalták össze, és az alábbiak szerint kategorizálhatók: (i) egylépéses tenyésztési protokoll, ahol a primer kultúrát 7 napig vagy tovább hagyták érintetlenül az első kolóniák megjelenéséig , (ii) kétlépéses tenyésztési protokoll, ahol a kultúrában töltött 5 nap után nem kötődött amniocitákat gyűjtötték és tovább szaporították , (iii) sejtfelszíni marker szelekció a CD117 (c-kit receptor) számára , (iv) a kezdeti kultúrákban kialakult kezdeti mesenchymális progenitor sejtkolóniák mechanikus izolálása , és (v) rövid távú kultúrák a fibroblastoid kolóniák elkülönítésére . Az e módszerek szerint izolált AFSC-k többsége multipotens mesenchymális fenotípust mutatott, és a felnőtt MSC-khez képest magasabb proliferációs potenciált és szélesebb körű differenciálódási potenciált mutatott .

1.2 . Magzatmembrán (AM)

A magzatmembrán, amelyből hiányzik minden érszövet, a magzatmembrán belső rétegének nagy részét alkotja, és 3 rétegből áll: (i) egy hámsejtekből álló epithelialis monorétegből, (ii) egy acelluláris intermedier bazális rétegből és (iii) egy külső, mesenchymális őssejtekben gazdag, a chorion közvetlen közelében elhelyezkedő mesenchymális sejtrétegből . Az AM-et a klinikumban évtizedekig használták égési sérülések sebgyógyítására, a hámképződés elősegítésére és a fertőzések elleni védelemre . A közelmúltban az AM használatát sebkötöző anyagként értékelték a szájnyálkahártya sebészeti defektusainak , a szemfelszín rekonstrukciójának , a szaruhártya perforációinak és a hólyagpótlásnak a kezelésére.

1.2.1 . Magzatmembrán őssejtek (AMSCs)

A magzatmembrán őssejtek (AMSCs) két típust foglalnak magukban, a magzatmembrán epithelialis sejteket (AECs) és a magzatmembrán mesenchymalis őssejteket (AM-MSCs), amelyek a magzatmembrán epithelialis, illetve a magzatmembrán mesenchymalis rétegéből származnak . Mindkét sejttípus a fejlődő embrió pregasztrációs szakaszában, a három elsődleges csíraréteg kirajzolódása előtt keletkezik, és többnyire epithelialis jellegű . Az AEC-k és AM-MSC-k izolálására számos protokollt hoztak létre, amelyek elsősorban az AM mechanikus elválasztásán alapulnak a chorionmembránból és az azt követő enzimatikus emésztésen . Az AM-MSC-k plasztikus tapadást és fibroblasztoid morfológiát mutattak, míg az AEC-k macskaköves epiteliális fenotípust mutattak. Az AM-MSC-k hasonló fenotípusos jellemzőkkel rendelkeztek, mint a felnőtt forrásból származó sejtek. Még érdekesebb, hogy az AM-MSC-k az AF-MSC-khez hasonlóan magasabb proliferációs rátát mutattak a felnőtt forrásokból származó MSC-khez képest, és a három csírarétegből származó sejtekké való multilineáris differenciálódási potenciált mutattak.

2. Immunfenotípus

2.1. Magzatvíz őssejtek

A magzatvíz a közelmúltban a különböző őssejt eredetű sejtek alternatív magzati forrásaként jelent meg . A következőkben az AFSC-ket jellemző legfontosabb markerek összefoglalása a célunk. A mai napig az MSC-k képviselik az AFSC-k legjobban jellemzett alpopulációját. Az AF-MSC-k tipikus mesenchymális markerek expresszióját mutatták, mint például a CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 és CD44, áramlási citometriás elemzésekkel meghatározva . Ezenkívül ezek a sejtek kifejezték a HLA-ABC antigéneket, míg a vérképzőszervi markerek CD34 és CD45, az endoteliális marker CD31 és a HLA-DR antigén kifejeződése nem volt kimutatható . Ennél is fontosabb, hogy a tenyésztett AF-MSC-k többsége pluripotenciális markereket fejezett ki, mint például az oktamer kötő fehérje 3/4 (Oct-3/4), a Nanog (Nanog) homebox transzkripciós faktor és a stádium-specifikus embrionális antigén 4 (SSEA-4) .

Azt is jelentették, hogy az amniocitakultúrák tartalmaznak egy kis populációt CD117 (egy elsősorban ESC-kben és primordiális csírasejtekben jelen lévő őssejtfaktorra specifikus tirozin-kináz) pozitív sejteket, amelyek kultúrában klonálisan terjeszthetők . A CD117+ AFS-ek differenciálódási tulajdonságait először vizsgálták in vivo, ezzel bizonyítva őssejt-azonosságukat . Kísérleti bizonyítékok arra utaltak, hogy az AFSC-k orsó alakú fibroblastoid sejtekből származnak .

Az AFSC-k alpopulációinak elemzésére tett kísérlet során csoportunk nemrégiben azonosította a mesenchymális eredetű AFSC-k két morfológiailag különböző, eltérő proliferációs és differenciálódási tulajdonságokkal rendelkező populációját, amelyeket orsó alakú (SS) és kerek alakú (RS) sejteknek nevezünk . Mindkét alpopuláció hasonló mértékben expresszált mesenchymális őssejt markereket. Azonosították azonban, hogy az SS kolóniák magasabb szinten fejezik ki a CD90 és CD44 antigéneket, mint az RS kolóniák .

2.2. Magzatmembrán őssejtek (AMSC-k)

Az AMSC-k részletes immunfenotípus-elemzése olyan antigének expresszióját mutatta ki, mint a CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , stromális őssejt marker 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, kollagén I és III (Col1/Col3), alfa-simaizomaktin (α-SMA), CD44, vimentin (Vim), fibroblaszt felszíni fehérje (FSP) és HLA-ABC antigén . Az intercelluláris adhéziós molekula 1 (ICAM-1) azonban nagyon alacsony szinten fejeződött ki, és a TRA-1-60, a vaszkuláris sejtadhéziós fehérje 1 (VCAM-1), a von Willebrand-faktor (vWF), a trombocita endotélsejt-adhéziós molekula (PECAM-1), a CD3 és a HLA-DR nem volt kimutatható . Az AM-ból származó sejtekben található egyik leggyakoribb fehérje a laminin, amely kulcsszerepet játszik a differenciálódásban, a sejtek alakjában és migrációjában, valamint a szöveti regenerációban . Az RT-PCR-elemzés továbbá kimutatta, hogy az AMSC-k olyan géneket fejeznek ki, mint az Oct-3/4, a cink-ujj fehérje 42 (zfp42 vagy Rex-1), az őssejt faktor fehérje (SCF), a neurális sejtadhéziós molekula (NCAM), a nestin (NES), a csontmorfogenetikai fehérje 4 (BMP-4), a GATA kötő fehérje 4 (GATA-4) és a hepatocita nukleáris faktor 4α (HNF-4α) még magas passzázsban is. Brachyury, fibroblaszt növekedési faktor 5 (FGF5), párosított doboz fehérje (Pax-6) és csontmorfogenetikai fehérje 2 (BMP2) transzkriptumokat nem mutattak ki . Hasonlóképpen, az AEC-k pozitívak voltak a CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, és negatívak a CD14, CD34, CD45, CD49d és HLA-DR expressziójára, ahogyan azt a FACS elemzések megállapították . További vizsgálatok kimutatták, hogy az AEC-k olyan őssejtmarkereket fejeznek ki, mint az SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, a nemet meghatározó régió Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 és Tra1-80, a fibroblaszt növekedési faktor 4 (FGF4), Rex-1, kriptikus fehérje (CFC-1) és prominin 1 (PROM-1) .

3. Transzkriptomika

3.1. Transcriptomics

3.1. Magzatvíz őssejtek

Az AF-MSC-k génexpressziós szignatúrájának funkcionális elemzését a csontvelő- (BM-), a köldökzsinórvér- (CB-) és az AM-MSC-kkel összehasonlítva eredetileg Tsai és munkatársai végezték el. A mindhárom forrásból származó MSC-kben kifejeződő géneket a következő csoportokba lehetett sorolni: i. extracelluláris mátrix átalakítás (CD44, kollagén II (COL2), inzulinszerű növekedési faktor 2 (IGF2), és a metalloproteináz 1 szöveti inhibitora (TIMP1)), (ii) citoszkeletális szabályozás (urokináz típusú plazminogén-aktivátor (PLAU) és receptor (PLAUR)), (iii) kemokin szabályozás és adhézió (alfa-aktinin 1 (ACTN1), aktinnal kapcsolatos fehérje komplex alegység 1B (ARPC1B) és tromboszpondin 1 (THBS1)), iv) plazminaktiváció (szöveti faktor útvonal gátló 2 (TFPI2)), (v) transzformáló növekedési faktor β (TGFβ) receptor jelátvitel (caveolin 1 (Cav1), caveolin 2 (Cav2), ciklinfüggő kináz inhibitor 1A (CDKN1A)), és vi) E3 ubikvitin ligázokat kódoló gének (SMURF) . Az AF-MSC-kben a BM-, CB- és AM-MSC-khez képest felszabályozott gének közé tartoztak a méh érésében és összehúzódásában részt vevő molekulák, mint például az oxitocinreceptor (OXTR) és a prosztaglandinszintézis szabályozása, mint például a foszfolipáz A2 (PLA2G10). Más felszabályozott gének ebben a csoportban a (i) trombin kiváltotta válaszhoz ((F2R és F2RL)), (ii) hedgehog jelátvitelhez ((hedgehog aciltranszferáz (HHAT)) és (iii) G-fehérjékkel kapcsolatos útvonalakhoz (rho-related GTP-binding protein (RHOF), regulator of G protein signaling 5 and 7 (RGS5, RGS7) és foszfolipáz C béta 4 (PLCB4)) kapcsolódó jelátvitelben vettek részt .

Az AFSC-ken végzett legújabb vizsgálatokban Kim és munkatársai először írták le a teljes AFSC-populáció génexpressziós változásait a különböző passzázsok során illumina microarray analízissel. 1970 differenciálisan expresszált gént detektáltak, és expressziós profiljuk alapján 9 különböző klaszterbe sorolták őket . A fokozatosan növekvő expressziós szintet mutató gének közé tartozott a kemokin (C-X-C motívum) ligand 12 (CXCL12), a cadherin 6 (CDH6) és a folátreceptor 3 (FOLR3). Lejjebb szabályozott gének voltak többek között a ciklin D2 (CCND2), a keratin 8 (K8), az IGF2, a natriuretikus peptid prekurzor (BNP) B és a celluláris retinsavkötő fehérje 2 (CRABPII) . További információk megszerzése érdekében az öregedési génekre vonatkozó chip-adatelemzést végeztek, és olyan génátírások felregulációját mutatták ki, mint a béta idegnövekedési faktor (NGFβ), az inzulinreceptor 2 szubsztrát (IRS-2), az inzulinszerű növekedési faktor kötőfehérje 3 (IGFBP-3) és az apolipoprotein E (APOE). Gének expressziója, például PLAU, E2F transzkripciós faktor 1 (E2F1), IGF2, mellrák 1-es típusú fogékonysági gén (BRCA1), DNS topoizomeráz 2-alfa (TOP2A), proliferáló sejtmag antigén (PCNA), forkhead box M1 (FOXM1), ciklin-A2 gén (CCNA2), benzimidazol 1 homológ béta (BUB1B) és ciklinfüggő kináz 1 (CDC2), a tenyésztés során fokozatosan szabályozódott le.

Wolfrum és munkatársai az AFSC-k globális génexpressziós elemzését végezték az AF-ből származó iPSC-kkel (AFiPSC) és az ESC-kkel összehasonlítva . Ezek közül az önmegújulással és a pluripotenciával kapcsolatos gének (1299 gén, pl. POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, mikroRNS-kötő fehérje LIN28) és az AFSCs-specifitás (665 gén, pl. , OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatózis 2. típus (NF2), protectin (CD59), tumor nekrózis faktor szupercsaládi tag 10 (TNFSF10), 5′-nukleotidáz (NT5E)) AFSC-kben kimutatták . A szerzők megvizsgálták továbbá a szeneszcenciához és a telomerekhez kapcsolódó gének expresszióját a korai és későbbi passzázsú AFSC-kben, hogy tanulmányozzák az átprogramozás hatását az AFSC-kultúrákban megfigyelt szeneszcencia megkerülésére. Hatvannégy gént azonosítottak, amelyek eltérően fejeződtek ki az AFSC-kben az AFiPSC-vonalakhoz képest. Ezek közül a teloméra-asszociált gének és a sejtciklus szabályozásában részt vevő gének, mint a mitotic arrest deficient-like 2 (MAD2L2), a poli ADP-ribóz polimeráz 1 (PARP1), a replikációs fehérje A3 (RPA3), a dyskeratosis congenita 1 (DKC1), a mutS homológ 6 (MSH6), a CHK1 checkpoint homológ (CHEK1), a polo-like kináz 1 (PLK1), a POU class 2 homeobox 1 (POU2F1), a CDC2, a Bloom-szindrómás RecQ helikázszerű gén (BLM), a Werner-szindrómás RecQ helikázszerű (WRN), a DNS-metiltranszferáz 1 (DNMT1), a DNS-metiltranszferáz 3 béta (DNMT3B), a lamin B1 (LMNB1) és a DNS-replikációs faktor 1 (CDT1), az AFSC-kben az AFiPSC-khez és az ESC-khez képest le volt szabályozva. Ezzel szemben a peptidilprolil cisz/trans izomeráz (PIN1), a lamin A/C (LMNA), a növekedési leállás és DNS-károsodás indukálható alfa (GADD45A), a chromobox homológ 6 (CBX6), a NADPH oxidáz 4 (NOX4), az endoglin (ENG), hiszton H2B típus 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A növekedési differenciálódási faktor 15 (GDF15) és szerin proteáz inhibitor 1 (SERPINE1), többek között az AFSC-kben az AFiPSC-khez és az ESC-khez képest felszabályozottak voltak.

3.2. Magzatmembrán őssejtek

Az AM-MSC-k esetében DNS-mikrocsíkok segítségével végzett transzkriptomikai elemzésről számoltak be . Ezek a kísérleti adatok információt szolgáltattak az AM-MSC génexpressziós mintázatáról, összehasonlítva az AF, CB és BM-MSC génexpressziós profiljaival. Az AM-MSC-kben számos felszabályozott gént azonosítottak, amelyek részt vesznek az immunadaptáció szabályozásában az anyaplacentáris határfelület között. Többek között a spondin 2 (SPON2), az interferon, alfa indukálható fehérje 27 (IFI27), a bradykinin receptor B1 (BDKRB1), a kis indukálható citokin B alcsalád 5. és 6. tagja (SCYB5, SCYB6) és a Yamaguchi szarkóma vírussal kapcsolatos onkogén homológ (LYN) géneket találták szabályozottnak . Ezenkívül az AM-MSC-kben az AF, CB és BM-MSC-khez képest megnövekedett expressziójú gének közé tartoztak (i) az olyan transzkripciós faktorok, mint a forkhead box F1 (FOXF1), a szív- és neurális gerincszármazékok kifejezett 2 (HAND2) és a 21-es transzkripciós faktor (TCF21) és (ii) metabolikus enzimek, mint a dipeptidil-peptidáz 6 (DPP6), a triptofán 2,3-dioxygenáz (TDO2) és a szialiltranszferázok (ST) .

4. Proteomika

4.1. Magzatvíz őssejtek

A teljes AFSC-populáció – beleértve az epithelioid (E-típusú), magzatvíz-specifikus (AF-típusú) és fibroblasztikus (F-típusú) sejteket – proteomikai vizsgálatai 2400 foltot mutattak ki, amelyek 432 különböző géntermék azonosítását eredményezték. A fehérjék többsége a citoplazmában (33%), a mitokondriumokban (16%) és a sejtmagban (15%) lokalizálódott, és főként enzimeket (174 fehérje) és strukturális fehérjéket (75 fehérje) képviseltek. Viszonylag nagy arányban voltak jelen membrán és membránhoz kapcsolódó fehérjék is (7%) . A kimutatott fehérjék közül 9 volt a hámsejteknek megfelelő, mint például ATP-szintáz D-lánc (ATP5H), NADH-ubikinon oxidoreduktáz 30 kDa alegység (NUIM), annexin II (Anx2), annexin IV (Anx4), 40S riboszomális fehérje SA (Rpsa), glutation S-transzferáz P (GSTP), major vault protein, valamint a 19-es és 7-es citokeratinok (CK-19, CK-7), míg a fibroblasztokban 12 fehérje kifejeződését jelentették, köztük a fibronectinek, tropomyozinok, transzgelin (TAGLN), arp2/3 komplex 34 kDa alegység (P34-arp), gelsolin (Gsn), elongációs faktor 1-β (EF-1β) és mások. Nyolc fehérjét találtak keratinocitákban kifejeződőnek, köztük keratinokat, ribonukleoproteineket, Anx2-t, aetil-CoA acetil-transzferázt (ACAT1) és másokat, hármat epidermiszben kifejeződőnek, köztük tropomiozinokat és keratinokat, egyet pedig mesenchymális sejttípusban (vimentin 1 (Vim 1)) .

A közelmúltban végzett vizsgálatok bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy az amnionsejtekben a metabolikus enzimek expressziójának sokfélesége részt vesz a metabolikus és genetikai szindrómákban, és így kimutatásuk fontos lehet a prenatális diagnosztikában. Az AFSC-kben jelen lévő specifikus metabolikus enzimek meghatározására szolgáló részletesebb elemzésről Oh és munkatársai számoltak be. Kilencvenkilenc fehérjét azonosítottak, például szénhidrátkezelő enzimeket, aminosavkezelő enzimeket, a purin-anyagcsere fehérjéit és a köztes anyagcsere enzimjeit .

A CD117+ AFSC-k különböző tenyésztési szakaszain is végeztek proteomikai elemzést, amely a fehérjeexpresszió eltéréseit mutatta, amelyek főként a korai szakaszokon jelentkeztek . Huszonhárom fehérje expressziója különbözött a korai és a késői passzázsok között, a leginkább ragadósan downregulált fehérjék a Col1, a Col2, a vinculin (Vcl), a CRABP II, a stathmin (STMN1) és a cofilin-1 (CFL1) voltak. Ezzel szemben a TAGLN és a Col3 megnövekedett a passzázsok során . A passzázsok mentén diszregulált szintet mutató fehérjék a 26S proteáz szabályozó alegység 7 (PSMD7), az ubikvitinkarboxil terminális hidroláz izoenzim L1 (UCH-L1), a heterogén nukleáris ribonukleáris fehérje H (hnRNP H) és a TAR DNS-kötő fehérje 43 (TDP-43) voltak .

2007-ben elkészítették a humán AF-MSC-k proteomikai térképét, és közvetlenül összehasonlították a BM-MSC-kből származóval . 261 különböző fehérjét azonosítottak az AF-MSC-kben, a fehérjék többsége a citoplazmában lokalizálódott (41%), míg mások az endoplazmatikus retikulumban (8%), a sejtmagban (13%), a mitokondriumokban (12%), a riboszómákban (1%), a citoszkeletonban (6%), a citoplazmában és a sejtmagban (5%), valamint a szekretált (2%) fehérjékben . Az AF-MSC-k számos, a proliferációval és a sejtek fenntartásával kapcsolatos fehérjét expresszáltak, mint például az ubiquilin-1 (UBQLN1), amelyről ismert, hogy szabályozza a sejtciklus progresszióját és a sejtnövekedést, a proliferációhoz kapcsolódó fehérje 2G4 (PA2G4), egy nukleoláris növekedést szabályozó fehérje, a szekretált savas és ciszteinben gazdag fehérje (SPARC), amely az embriogenezis során szabályozott, és részt vesz a sejtciklus és a sejtadhézió szabályozásában, valamint az ERH (enhancer of rudimentary homolog), amely szintén szabályozza a sejtciklust . A TAGLN és a galektin 1 (Gal 1), amelyek mindketten jelen vannak az őssejtekben és kapcsolódnak a differenciálódáshoz, szintén bőségesen kifejeződtek az AF-MSC-kben. Az AF-MSC-kben nagy mennyiségben expresszálódó egyéb fehérjék (i) a fejlődéshez kapcsolódtak, mint például a Deltex-3-szerű (DTX3L), és (ii) a citoszkeletális szerveződéshez és mozgáshoz, mint például a CFL1, a koaktozinszerű fehérje (CLP) és az enabled protein homológ (Enah). A várakozásoknak megfelelően a Vim is nagy mennyiségben fejeződött ki az AF-MSC-kben. Ebben a tanulmányban az AF sejtekben és AF-MSC-kben azonosított közös fehérjék részletes összehasonlítását is leírtuk .

Későbbi tanulmányunkban , 2-DE segítségével létrehoztuk a két morfológiailag különböző AF mesenchymális progenitor sejttípus (SS és RS) proteomikai térképét. A két alpopulációban huszonöt fehérje volt differenciálisan expresszálva. Az SS-AF-MSC-kben az RS-AF-MSC-khez képest feljebb szabályozott fehérjék közé tartozott a retikulokalbin-3 prekurzor (RCN3), a kollagén α1 (I) (COL1α1), az FK506-kötő fehérje 9 prekurzor (FKBP9), a Rho GDP-diszszociációs inhibitor 1 (RhoGDI), a klorid intracelluláris csatorna fehérje 4 (CLIC4), a triptofanyl-tRNS-szintetáz (TrpRS) és a 70 kD hősokkfehérje (HSP70). A peroxiredoxin 2 (Prdx2), a 60 kD hősokkfehérje (HSP60), a GSTP és az Anx4 felszabályozott volt az RS-AFMPC-kben. Az RS-AF-MSC-kben azonosított fehérjék között azonban csak a citokeratin-8, -18 és -19 (CK-8, -18 és CK-19), a kathepszin B (CTSB), a CLP és az integrin αV fehérje (CD51) szerepelt. A mesenchymával kapcsolatos fehérjék, mint a Vim, Gal, Gsn és prohibitin (PHB), mindkét populációban azonos szinten fejeződtek ki .

4.2. Magzatmembrán őssejtek

A humán AM fehérjék vizsgálatának részletes megközelítését Hopkinson és munkatársai írták le . Ebben a tanulmányban a szerzők humán transzplantációra előkészített AM minták proteomikai elemzését végezték el 2-DE gélek segítségével. Az AM-mintákból származó mosóközegeket is megvizsgálták, és azonosították a szekretált fehérjéket. Az AM-ben és a mosóközegben egyaránt kimutatott fehérjék arra utaltak, hogy részleges fehérjefelszabadulás történt. Ezek a fehérjék többnyire oldható citoplazmatikus fehérjék voltak, és szubcelluláris lokalizációjuk és funkciójuk szerint kategorizáltuk őket . Az AM-ben leggyakrabban előforduló és legkövetkezetesebb fehérjék egyike például a THBS1 , amely a jelentések szerint szerepet játszik a sebjavításban, a gyulladásos válaszban és az angiogenezisben . A mimecan (más néven osteoglycin/OGN) egy másik AM-ben kimutatott fehérje, amely egy kis leucinban gazdag proteoglikán, amely a kötőszövet ECM-ében található. A jelentések szerint a mimecan fenntartja a szövet szakítószilárdságát és hidratáltságát . Ezenkívül a mimecan nagyobb formája kifejeződött az AM sejtekben, és érzékeny volt a proteolitikus hasításra . A TGF-β-indukált fehérje ig-h3 (βIG-H3), egy ECM adhéziós molekula, amely membrán-asszociált növekedési faktorként működik a sejtdifferenciálódás és a sebgyógyulás során, és az α6β4 integrin egyik összetevője, az intergrin α6 (CD49f) szintén jelentős mennyiségben volt jelen az AM sejtekben . Jól ismert, hogy az α6β4-βIG-H3 kölcsönhatás fontos szerepet játszik a sejtadhézió és a sebgyógyulási jelátviteli útvonalak közvetítésében .

A Baharvand és munkatársai által végzett másik fontos vizsgálat a hámtól megtisztított emberi AM elemzésére összpontosított, amely mennyiségi és minőségi különbségeket mutatott a kezeletlen AM-hez képest . Vizsgálták a humán AM epithelium proteomját, amelyet limbális őssejt niche-ként használtak a szemfelszín rekonstrukciójának kezelésére . Az összes 2-DE gélben 515 foltot detektáltak, és 43 fehérjét azonosítottak MALDI TOF/TOF MS segítségével az AM-ben. A legnagyobb mennyiségben előforduló fehérjék a lumikán (LUM) és az OGN különböző izoformái voltak, mindkettő a proteoglikán (PG) család tagja. Különösen az OGN játszhat szerepet számos biológiai folyamatban, beleértve a sejtnövekedést, az angiogenezist és a gyulladást . Más kimutatott fehérjék közé tartozott a kollagén VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), fibrinogén béta-lánc (FGB), transzglutamináz 2 izoforma A (TGM2A), b-aktin variáns (ACTB), 70 kD hősokkfehérje 5 (HSPA5), nidogén 2 (NID2), CD49f, βIG-H3 és tubulointerstitialis nephritis (TIN) . Az ebben a vizsgálatban azonosított fehérjék közül néhány az extracelluláris mátrixhoz (ECM) is kapcsolódott. Az észleltek közül a fibronectin (FN), a lamininek, valamint a kollagén IV (Col4) és VII a jelentések szerint elősegítik a hám adhézióját és migrációját .

5. Szekretom

A közelmúltban jelentős előrelépés történt az AFSC-kből szekretált fehérjék elemzése terén. Dokumentálták, hogy az AFSC szekretom felelős a vaszkulogenezis fokozásáért és képes volt erős angiogén választ kiváltani egér recipiensekben . E tanulmány szerint az AFSC-kondicionált médium részletes elemzése a Luminex MAP technológiája segítségével kimutatta az ismert proangiogén és antiangiogén faktorok jelenlétét. Szekretált fehérjékként azonosították a vaszkuláris endotél növekedési faktort (VEGF), a sztróma sejtekből származó 1-es faktort (SDF-1), az interleukin 8-at (IL-8), a monocita kemotaktikus fehérje 1-et (MCP-1) és két angiogenezis gátlót, az interferon-gamma (IFNγ) és az interferon-gamma indukált 10-es fehérjét (IP-10) . Azt is kimutatták, hogy viszonylag kis számú AFSC elegendő ahhoz, hogy kimutatható mennyiségű proangiogén növekedési faktort és citokint szekretáljon. Ezek szekréciója dózisfüggő módon szabályozható a felhasznált sejtek kiindulási sejtszámától függően .

Az AFSC-k által szekretált fehérjék szisztematikus vizsgálata arra a következtetésre vezetett, hogy az AFSC-kből származó proangiogén oldható faktorok képesek közvetíteni az endoteliális progenitorok toborzását egy iszkémiás patkánymodellben . Különösen az AFSC-kből származó kondicionált médium képes volt helyileg angiogén növekedési faktorokat és citokineket juttatni az iszkémiás patkánymodell bőrlebenyébe, és felelős volt az endogén javulás beindításáért az endoteliális progenitor sejtek toborzásával .

A közelmúltban végzett vizsgálatainkban az AF-MSC-k és szekretált molekuláik terápiás potenciálját vizsgáltuk akut májelégtelenségben szenvedő egerekben . Az AF-MSC-k kondicionált médiumában számos citokint és növekedési faktort mutattunk ki. Olyan citokineket mutattunk ki, mint az interleukin 10 (IL-10), interleukin 27 (IL-27), interleukin 17 család (IL-17E), interleukin 12p70 (IL-12p70), interleukin-1 béta (IL-1β) és interleukin-1 receptor antagonista (IL-1ra), amelyek a pro-inflammatorikus mediátorok helyi és szisztémás downregulációjáért felelősek. A szövetek helyreállításának elősegítéséért felelős SERPINE1, MCP-1 és SDF-1 is szekretálódott. Érdekes módon a magasan expresszálódó növekedési faktorok között volt a vérlemezke-eredetű endotélsejt növekedési faktor (PD-ECGF), endosztatin/kollagén XVII (EN/Col17), vizelet plazminogén aktivátor (uPA), TIMP1, TIMP2, heparin-kötő EGF-szerű növekedési faktor (HB-EGF), fibroblaszt növekedési faktor 7 (FGF7) és epidermális növekedési faktor (EGF), amelyek a máj regenerációjáért és a szövetek helyreállításáért felelősek .

6. Összefoglalás

A jelenlegi eddigi adatok arra utalnak, hogy a magzatvíz és a magzatmembrán ígéretes forrást jelenthet a mesenchymális eredetű őssejtek számára. Az MSC-k valóban nagyobb mennyiségben fordulnak elő, és izolálásukhoz számos protokollt leírtak. Ugyanakkor arról számoltak be, hogy az azonos típusú sejtek eltérő tenyésztési körülményei befolyásolhatják eltérő génexpressziós mintázatukat, ami korlátot jelent az in vitro izolálásuk és terjeszkedésük során. A fenotípusos elemzést is magában foglaló, olyan módszereket, mint az áramlási citometria és az immunhisztokémia, valamint a transzkriptomikai, proteomikai és szekretomikai elemzési megközelítéseket alkalmazó vizsgálatok célja e sejtek fehérjeprofiljának meghatározása (1. ábra). Az ilyen vizsgálatokból származó adatok várhatóan tisztázzák differenciális repertoárjukat és validálják ezen őssejtek molekuláris profilját. A fő kérdés azonban, amellyel sürgősen foglalkozni kell, egy olyan homogén populáció izolálása, amely megkönnyítheti e multipotens sejtek funkciójának feltárását célzó szisztematikus vizsgálatokat.

1. ábra

A transzkriptomikai, proteomikai, szekretomikai és immunfenotípusos elemzések segítségével az AFC-kben és AMC-kben azonosított legfontosabb markerek összefoglalása. Az egynél több tanulmányban azonosított fehérjéket félkövérrel jelöltük.

Az ilyen megközelítések olyan kulcsfontosságú antigének azonosításához vezethetnek, amelyek tükrözik e sejtek fenotípusát, és magyarázatot adnak az eltérő tulajdonságaikra. Az ilyen típusú vizsgálatok megnyitják az utat e sejtek szisztematikus és hatékony izolálása előtt, mielőtt klinikai felhasználásra kerülnének.

Függelék

További vizsgálandó kérdések

Melyek az AFSC-k vagy AMSC-k megfelelő izolálási módszerei és tenyésztési körülményei, amelyek lehetővé teszik az egységes fenotípus azonosítását?

Létezik egyetlen marker, amely használható az AFSC-k vagy AMSC-k elkülönítésére?

Az AFSC- és AMSC-populációk heterogének, és fenotípusos és molekuláris tulajdonságaikban különböznek. Az izolálás módszerei homogén sejtpopulációt eredményezhetnek.

Az AFSC-k vagy az AMSC-k a regeneratív gyógyászat eszközeiként használhatók: minimális vagy állati anyagokat nem tartalmazó tenyésztési körülmények létrehozása.

Markerek felfedezése
Az AFSC-k és az AMSC-k kezdeti jellemzése immunfenotípus-elemzéssel végezhető jól jellemzett sejtfelszíni markerek, például AFSC-k használatával: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSC-k: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1 és PROM1.

Transcriptomics and Proteomics Revealed the Identification of Key Markers Expressed such as
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1 és Gal; AMSCs:
Mivel nem áll rendelkezésre közös marker az AFSC és az AMSC számára, szélesebb körű markerpanelt kell alkalmazni. Ez további részletes array és funkcionális elemzések elvégzését is sürgeti az AFSC és AMSC jellemzéséhez legmegfelelőbb markerek meghatározása érdekében.

Érdekütközések összeférhetetlensége

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek érdekellentétek.