A dNTP a dezoxiribóz-nukleotid-trifoszfátot jelenti, amelyet a PCR-ben a növekvő DNS-szál bővítésére használnak.A dATP, dTTP, dGTP és dTTP a PCR-ben használt négy gyakori dNTP.
A dNTP-k funkciója a PCR-ben a növekvő DNS-szál bővítése a Taq DNS-polimeráz segítségével. Hidrogénkötésekkel kötődik a komplementer DNS-szálhoz.
A PCR a DNS-szintézis in vitro technikája. A PCR elvégzésének célja, hogy az érdeklődésünkre számot tartó DNS-töredékek többszörös kópiáját hozzuk létre, hogy azt gélelektroforézis alatt láthatóvá tegyük.
A PCR célja, hogy több millió DNS-kópiát készítsünk különböző downstream alkalmazásokhoz, mint például a DNS-szekvenálás vagy a DNS-mikroarray.
A polimeráz láncreakció felfedezése óta a molekuláris genetikai kutatásban használt páratlan eszköz. A PCR összetevői a DNS-sablon, a primerek, a puffer, a Taq DNS-polimeráz és a dNTP-k. A PCR mechanizmusának megértéséhez meg kell tanulnunk a benne használt minden összetevő fontosságát,
Ebben a cikkben a PCR egyik legfontosabb összetevőjét, a dNTP-ket tárgyaljuk. Megvizsgáljuk a szerkezetét is, és hogy miért olyan fontos.
Megbeszéljük továbbá a dNTP-k és a Taq DNS-polimeráz kölcsönhatásának mechanizmusát és a növekvő DNS-szálon való működésüket.
Megbeszéljük továbbá azt a mechanizmust, ahogy a dNTP-k és a DNS-polimeráz kölcsönhatásba lépnek egymással, és segítik a DNS-szál növekedését.
A PCR-rel kapcsolatos cikkek továbbolvasása,
- A DMSO szerepe a PCR-ben: A DMSO a PCR fokozója
- A taq DNS-polimeráz funkciója a PCR-ben
- PCR primer tervezési útmutató
- A MgCl2 szerepe a PCR reakcióban
Mik a dNTP-k?
A dNTP-k a PCR-ben használt mesterséges nukleotidok, amelyeket a DNS replikációhoz hasonlóan új DNS szálak szintézisére használnak. dATP, dTTP, dGTP, dTTP a PCR mastermixben található gyakori nukleotidok.
A dNTP-k szerkezete:
A dNTP a dezoxiribóz nukleotid-trifoszfátot jelenti.
A dNTP-k megértéséhez először is meg kell értenünk néhány alapfogalmat, mint például bázis, nukleotidok, nukleozidok, nukleozidok, ribonukleotidok, dezoxiribonukleotidok, dideoxiribonukleotidok. Ezek a genetikában rutinszerűen használt alapfogalmak, mégis, az emberek félreértik.
Az adenin és a guanin purin bázisok, míg a citozin és a timin pirimidin bázisok. A nitrogén bázisok nem tudnak közvetlenül DNS-t alkotni. Foszfátgerinc és pentózcukor szükséges továbbá a DNS molekula létrehozásához.
A nukleotid egy pentózcukorból, foszfátból és nitrogénbázisból áll. Az egyik nukleotid foszfodiészterkötéssel kötődik egy másik szomszédos nukleotidhoz, míg az egyik nukleotid hidrogénkötéssel kötődik egy másik nukleotidhoz az ellentétes DNS-szálon.
A kép a dezoxiribóz-trifoszfát, a difoszfát és a monofoszfát szerkezetét ábrázolja.
A DNS szerkezetéről bővebben olvashat: DNS-történet: The structure and function of DNA
A nukleotidban lévő foszfát trifoszfát, (tri-három) ha a foszfát nem kapcsolódik a nukleotidhoz (vagy hiányzik), akkor nukleozidnak nevezzük (a foszfát nélküli nukleotidot nukleozidnak nevezzük).
Ha a pentózcukorban a hidroxilcsoport helyébe hidrogénatom lép, a cukrot dezoxicukornak nevezzük. A DNS dezoxi-pentózcukorból, míg az RNS csak ribózcukorból áll.
A dNTP-k ribózból, nitrogénbázisból és foszfátból álló nukleotidláncok.
A ddNTP-k különböznek a dNTP-ktől.
A dideoxinukleotid-trifoszfátnak nincs szabad 3′ OH-csoportja, a cukor másik 3′ OH-csoportját hidrogén helyettesíti.
Ezért nem okozhatja a növekvő DNS-szál tágulását. Tehát ezeket a ddATP, ddTTP, ddCTP és ddGTP típusokat használják a DNS-szekvenálásban. A ddNTP-k szekvenálásban betöltött szerepét egy másik cikkben részletesen tárgyaljuk.
A ddNTP-ket a láncvégző módszerben használják a DNS-szintézis bővülésének leállítására.
A képen a ribózcukor, a dezoxiribózcukor és a dezoxiribózcukor közötti különbség látható. A trifoszfát három különböző foszfátmolekulából áll, amely a DNS gerincét adja.
A DNS foszfátgerince három különböző foszfátmolekulából áll, amelyeket alfa-, béta- és gamma-foszfátnak nevezünk. Ha egy foszfát vagy gamma-foszfát szabadul fel, a szerkezetet dezoxinukleotid-difoszfátnak nevezzük.
Hasonlóképpen, ha a három foszfátból kettő szabadul fel, a szerkezetet dezoxinukleotid-monofoszfátnak nevezzük.
A dATP és a dGTP purinok, míg a dCTP és a dTTP pirimidin dNTP-k, amelyeket a PCR-reakcióban használnak. A dNTP-k funkciója a PCR-ben ugyanaz, mint az in vivo replikációban. Ha érdekli a nukleotidok vs. nukleozidok és a purinok vs. pirimidinek közötti különbségek, olvassa el ezeket a cikkeket:
- Purinok vs. pirimidinek
- Nukleotidok vs. nukleozidok
A kép négy különböző dNTP szerkezetét ábrázolja.
A dNTP-k funkciója:
A dNTP-k a PCR, az RT-PCR, a DNS-szekvenálás vagy a DNS-mikroarray összetevői, amelyek segítik a DNS növekedését vagy a DNS felerősítését.
A hatásmechanizmus:
A PCR folyamata három hőmérsékletfüggő lépésre oszlik:
- Denaturálás
- Lágyítás
- Hosszabbítás.
A denaturációs lépésben a kettősszálú DNS egyszálúvá denaturálódik; Az annealing lépésben a primer pontosan ott kötődik, ahol a komplementer szekvenciája van, és,
A hosszabbítási lépésben a Taq DNS-polimeráz hozzáadja a dNTP-ket a növekvő DNS-szálhoz.
Mihelyt a szál megnyílt és a primer az egyszálú DNS-hez kötődik, a Taq DNS-polimeráz megkezdi katalitikus tevékenységét.
A Taq DNS-polimeráz az egyszálú DNS-t használja szubsztrátként az enzimatikus tevékenységéhez, és a primer-DNS-összeköttetésen telepszik le.
A Taq DNS-polimeráz egyik vége az oligonukleotid-primer 3′ OH-csoportjának közelében kötődik, ezt a komplexet P-DNS-komplexnek nevezzük.
A kép a DNS szerkezetét ábrázolja a hidrogénkötésekkel és a DNS foszfodiészterkötésével.
A következő lépésben megkezdődött a dNTP addíció.
A dNTP gyenge affinitással kötődik a P-DNS komplexhez, ha a pontos komplementer nukleotid jelen van. Nem sokkal később a Taq DNS-polimeráz megtartja, és létrejön a hidrogénkötéses kölcsönhatás a komplementer bázis és a dNTP között.
Itt kezdetben nem a teljes nukleotid, hanem a dNTP-n lévő bázis (nitrogén bázis) dönti el, hogy kötődik-e vagy sem.
Először is, ha a templát ssDNS-en megtalálja a komplementer bázist (A a T-hez és G a C-hez), akkor hidrogénkötést alakít ki közöttük. Három hidrogénkötés jön létre a C és a G között és két hidrogénkötés az A és a T között.
Mihelyt a hidrogénkötés kialakul, a Taq DNS-polimeráz foszfodiészterkötés kialakításával igazodik ahhoz, hogy a dNTP kötődése a növekvő DNS-szálhoz. Most a foszfodiészter kötés kialakulása után a Taq DNS-polimeráz egy lépéssel előre lép az új dNTP hozzáadásához.
A foszfodiészterkötés a primer 3′ OH-ja és a dNTP 5′ P-je között jön létre.
A hidrogénkötés kialakulása után a Taq DNS-polimeráz katalizálja a reakciót, eltávolítva a gamma- és béta-foszfátot a dNTP trifoszfátjából. A reakció befejezése után két pirofoszfát (PPi) szabadul fel.
A dNTP-k és a Taq-polimeráz kölcsönhatásának pontos kinetikája a PCR-reakció során még nem ismert.
Az agaróz gélelektroforézisről,
- Agaróz gélelektroforézis
- DNS gél betöltő festék
- Az EtBr szerepe az agaróz gélelektroforézisben
A dNTP-k koncentrációja a PCR-ben:
A 30-35 ciklusos PCR-reakcióhoz általában minden dNTP-ből 200μM elegendő.
200μM mindegyik, ami azt jelenti, hogy összesen 800μM 4 dNTP-keveréket használunk fel egyetlen PCR-reakcióban. A 100mM-os törzsoldatból kell elkészítenünk a munkakoncentrációnkat.
Az utóbbi napokban azonban nagyon népszerű és hatékony a kész mastermix. A használatra kész mastermix tartalmazza az összes fontos összetevőt, például a dNTP-keveréket, a gél betöltő festéket és a Taq DNS-polimerázt.
Amint tudományos diák vagyunk, meg kell hajolnunk, hogyan kell elkészíteni a munkaoldatot a készletből. Tegyük fel, hogy a 100mM törzsoldatból 2mM munkaoldatot kell készítenünk.
most,
emlékszel V1C1= V2C2?
Itt az adott C1 koncentráció 100mM (ami a dNTP-k készletkoncentrációja)
V1 az adott térfogat ismeretlen (?)
C2 a szükséges koncentráció = 2mM
V2 a szükséges térfogat= 1000μL
Most V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Itt, A munkaoldat elkészítéséhez minden dNTP-ből 20μL szükséges, így a keverékünk végső térfogata 80μL (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) 920μL D/W-ben.
Ezzel az egyes dNTP-k végső koncentrációja 2mM lesz 1000μL munkaoldatban. Számítsa ki a 200μM-ot saját maga.
A végső útmutatóm a dNTP-k PCR-ben való használatához
Mindig készítsen két törzsoldatos csövet, és tárolja az összes csövet -20°C-on.
Kalkulálja ki, hogy hány reakciót végez egy hét alatt, ennek megfelelően készítse el a munkaoldatot a törzsoldatból, és tárolja 4°C-on. Mivel az ismételt fagyasztás és felolvasztás csökkenti a dNTP-k aktivitását.
A munkaoldat elkészítése során mindig viseljen világítót és tartson steril körülményeket, mert az idegen DNS szennyeződése akadályozza a PCR-reakcióban.
A 200μM koncentráció elegendő a PCR-reakcióhoz, azonban hosszú távú PCR esetén az egyes dNTP-k 2 mM-3 mM koncentrációja is használható.
Amint nő a dNTP-k koncentrációja, úgy nő a nem specifikus kötődés mértéke. Hasonlóképpen, a dNTP-k szűkössége hiányos PCR-termékekhez vezet. Ezért mindig megfelelő mennyiségű dNTP-t használjon.
Következtetés:
Összegezve: A dNTP-k funkciója a PCR-reakcióban ugyanolyan fontos, mint a Taq DNS-polimerázé.
A Taq segítségével a dNTP-k kötődnek a növekvő DNS-szálhoz és bővítik azt. Ha nem szeretne mindezekkel a dolgokkal bajlódni, akkor használhat kész PCR-készletet, ami előnyösebb. Mégis, meg kell tanulnia a reagenskészítés kézi módszerét.