BIOPROCESS ENGINEERING
Evaluation of the microbial diversity of denitrifying bacteria in batch reactor
S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*
ABSZTRAKT
Az ipari aktivált iszap üzemben lévő mikrobiális közösségek hozzájárulhatnak a denitrifikációs folyamathoz, de a denitrifikáló reaktorokban jelen lévő mikroorganizmusokról még kevés az információ. A szervetlen nitrogénvegyületek eltávolítása szénforrások hozzáadásával érhető el a denitrifikáció biológiai folyamatához. Az etanol gazdaságilag életképes alternatíva szénforrásként a trópusi országokban, például Brazíliában, ahol nagy mennyiségben termelnek cukornádból. Ez a cikk beszámol az aktív iszap sikeres alkalmazásáról nitráttal és etanollal egy szakaszos anaerob reaktorban. A művelet 61,5 órán át tartott, a teljes nitrátfogyasztás 42,5 óra alatt, a nitrittermelés (2,0 mg/l) és az etanolfogyasztás (830,0 mg/l) 23,5 óra alatt történt. A denitrifikáló sejtek száma a legvalószínűbb szám szerint a művelet elején alacsonyabb volt, mint a végén, ami megerősíti az aktív iszapból származó inokulum denitrifikációs folyamatra való képességét. A mintákat a sejtszámok alapján Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. és kitenyésztetlen baktériumokként azonosították. Ezért ezek a fajok részt vehetnek a nitrát redukciójában és az etanol fogyasztásában a szakaszos reaktorban.
Kulcsszavak: Aktív iszapos rendszer; Acidovorax; Acinetobacter; Nitrát; Etanol.
BEVEZETÉS
A denitrifikációra képes mikroorganizmusok széles körben elterjedtek a természetben: talaj, üledék, édesvíz, tenger és szennyvíztisztító rendszerek (Park & Yoo, 2009).
A háztartási és ipari szennyvíztisztító telepekről származó számos inokulum tartalmazhat denitrifikáló baktériumokat, főként az aktív iszapos rendszerekben (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), ahol a biológiai nitrogén eltávolítás a denitrifikáció elősegítésére történik, azaz heterotróf anoxikus körülmények között a szerves szénforrások elektrondonorként működnek és a nitrátot nitrogéngázzá redukálják (Canto et al., 2008). A heterotróf denitrifikációhoz szerves szén- és energiaforrások jelenléte szükséges (Nava et al., 2010).
A denitrifikáló baktériumok többsége a Proteobacteria törzsbe tartozik, többek között az Acidovorax, a Comamonas és az Acinetobacter. A hulladékkezelésben, különösen az aktív iszapos rendszerekben jelen lehetnek ilyen baktériumok, amelyek nitrátból és exogén szénforrásból, például etanolból képesek molekuláris nitrogént képezni. A teljes denitrifikációt, azaz a nitrát nitrogéngázzá alakítását olyan baktériumfajok közvetítik, amelyek általában a levegőből származó oxigént használják energiaforrásként (aerob légzés), de képesek oxigén helyett nitrátot és nitritet is felhasználni (anoxikus állapot). Így ezek a baktériumok nitrát hiányában aerob módon, nitrát jelenlétében pedig anoxikus körülmények között növekedhetnek. A nitrát molekuláris nitrogénné történő átalakítását anoxikus légzésnek is nevezik (Park & Yoo, 2009).
A szerves vegyületek széles skáláját használták, mint például metanol, etanol, glükóz, acetát, aszpartát vagy hangyasav és aromás vegyületek (Queiroz et al., 2011). Az ivóvíz denitrifikációjával kapcsolatban közzétett kutatások többsége azonban metanol, etanol és ecetsav használatát foglalja magában (Park & Yoo, 2009). Az etanol (Daniel et al., 2009), a glükóz és az acetát néhány a denitrifikációhoz sikeresen alkalmazott külső elektrondonorok közül. Különösen Brazíliában az etanol jelent megvalósítható alternatívát (Gavazza dos Santos et al., 2004). Brazíliában 1975 óta nagy mennyiségben állítanak elő etanolt a Nemzeti Alkoholprogrammal (19751985). Brazília közel 2,6 x 108 tonna cukornádat termel, amelyet 324 cukorgyárban dolgoznak fel cukor és etanol előállítására (Borrero et al., 2003). A cukornádból bőségesen állítanak elő, és általában kevesebbe kerül, mint más kényelmes szénforrások. Mindazonáltal az exogén folyamathoz szükséges további elektrondonor-források szükségessége növeli az üzemeltetési költségeket, ami valószínűleg hátrányt jelent az innovatív anaerob folyamatalapú technológiák alkalmazása szempontjából (Gavazza dos Santos et al., 2004).
A bakteriális energiareakciót leíró sztöchiometriai összefüggéseket (Park & Yoo, 2009) az etanol szénforrásként történő felhasználása esetén a következőképpen írjuk fel:
0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O
Bár ez az egyenlet megmutatja a nitrát-diszszimilációhoz szükséges etanol sztöchiometrikus mennyiségét, további etanolra van szükség az oxigénmentesítéshez és a sejtszintézishez. A gyakorlatban a szükséges etanol 25-30%-át a baktériumsejt-szintézishez használják fel. Oldott oxigén jelenlétében az etanolszükséglet ennek megfelelően magasabb. Ezért a szubsztrát és a nitrát súlyarányának (C:N03) általános munkaértéke közel 3 (Park & Yoo, 2009).
A szakaszos reaktorokról és a denitrifikációs folyamatról csak néhány hivatkozás található. Ezek a konfigurációk felhasználhatók a tápanyagigény vizsgálatára (Maintinguer et al., 2008). A komplex szénhidrátokkal történő denitrifikációs folyamatot szakaszos reaktorokban értékelik, mivel az ezekben a rendszerekben jelen lévő szervesanyag-részecskék más konfigurációkban, például keményítővel történő denitrifikáció esetén megnehezíthetik a működést (Iamamoto, 2006). Ráadásul a folyamatos áramlású reaktorokhoz képest a biomassza minden üzemidőben a szakaszos reaktorban marad. Ezek a tények hozzájárulhatnak a szakaszos reaktorban igazolt teljes nitrátfogyasztáshoz (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).
A nitrát eltávolítását aktív iszap inokulummal különösen a mérsékelt éghajlatú országokban tanulmányozták. A trópusi országokból, például Brazíliából származó, aktíviszap-okulummal végzett nitráteltávolítással és molekuláris biológiával kapcsolatos vizsgálatokról kevés beszámoló van. Ebben az értelemben tanulmányunk első célja az volt, hogy értékeljük a denitrifikációs folyamatot trópusi éghajlatú területekről származó aktív iszappal mint inokulummal. Tanulmányunk második célja az volt, hogy elvégezzük az inokulum mikrobiológiai jellemzését, amelynek célja a denitrifikációs folyamatban specifikusan részt vevő potenciális organizmusok azonosítása volt.
Ez a munka a denitrifikáció mikrobiális diverzitását vizsgálta egy etanollal és nitráttal táplált szakaszos reaktorban molekuláris biológiai technikák és a hagyományos mikrobiológiai módszertan segítségével.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
Batch reaktor
A kísérletet a Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brazília) szennyvíztisztító telepének aktíviszapos rendszeréből származó iszappal végeztük.
A szakaszos reaktorokat három példányban készítettük 2 literes Duran® lombikokban, ahol 1 liter volt a reakcióközeg, 10% (v/v) inokulum (100 ml/l).
A reaktorokat az oldatok kiosztása után 20 percre N2 atmoszférába (99,99%) helyeztük. Ezt követően butilgumi dugókkal lezártuk, becsomagoltuk és 25 ºC ± 1 ºC-on tartottuk, 120 rpm-es keverés mellett 61,5 óra alatt működtetve.
Fizikai-kémiai és kromatográfiás analízis
Az összes illékony szilárd anyag (TVS) és a nitrátfogyasztás meghatározása az APHA, 2005 szerint történt, spektrofotometriásan. A nitritelemzést áramlásos injektálással végeztük (FIA APHA, 2005). Az illékony zsírsavakat és az alkoholokat gázkromatográfiásan határoztuk meg Shimadzu GC-2010 készülékben, lángionizációs detektorral, COMBI-PAL – AOC 5000-es modellel és HP-INNOWAX oszlop (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm filmvastagság) automatikus mintavevővel felszerelve, Maintinguer et al. szerint, 2008).
A denitrifikáló baktériumok mennyiségi meghatározása
A denitrifikáló baktériumok legvalószínűbb számának (MPN) meghatározása ötszörös hígítással történt a szakaszos reaktor működésének kezdetén és végén, Tiedje (1982) szerint, folyékony mintákra adaptálva. Az MPN-módszerrel végzett sejtszámlálást 15 napos inkubáció után végeztük, az APHA, 2005 szerint. Az MPN vizsgálatokhoz használt táptalaj összetétele és, nitrát és etanol koncentrációi hasonlóak voltak, mint a szakaszos reaktor üzemeltetésénél, ahogyan azt korábban említettük.
Molekuláris biológia
A 16S rRNS elemzéséhez szükséges mintákat a denitrifikáló baktériumok legnagyobb pozitív hígítású (MPN) számából nyertük a vizsgálat végén a szakaszos reaktorokból.
A minták teljes genomi DNS-ét üveggyöngyökkel (Sigma) végzett sejtlízis és fenol-kloroform extrakció után nyertük a Griffiths és munkatársai (2000) által korábban leírtak szerint, módosítva.
A polimeráz láncreakcióval (PCR) történő amplifikációt a 16S rRNS gén bakteriális domén primer készletével végeztük, 27 előre (5′-AGAGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) és 1100 hátra (5′-AGGGTTGCGCCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). A PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22,331) amplifikációt 94 ºC-on 5 percig tartó kezdeti denaturálással végeztük, amelyet 30 ciklus követett: denaturálás 94 ºC-on 45 másodpercig, lágyítás 55 ºC-on 45 másodpercig, hosszabbítás 72 ºC-on 1,45 percig és végső hosszabbítás 72 ºC-on 7 percig, majd hűtés 4 ºC-on.
A PCR (polimeráz láncreakció) termékeinek (16S rRNS) mintáit a pGEM plazmidvektorba (Promega Easy Vector System I) klónoztuk a gyártó előírásainak megfelelően. A klónokat véletlenszerűen kiválasztottuk és PCR-rel amplifikáltuk. A nukleotidszekvenálást automatizált ABI 310 PRISM szekvenálóval (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) végeztük a gyártó utasításainak megfelelően, M13 forward primer (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983) használatával. A PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) amplifikációt 94 ºC-on 2 percig tartó kezdeti denaturálással végeztük, amelyet 25 ciklus követett: denaturálás 94 ºC-on 1 percig, lágyítás 55 ºC-on 1 percig, hosszabbítás 72 ºC-on 1 percig; és végső hosszabbítás 72 ºC-on 7 percig, majd hűtés 4 ºC-on.
A nukleotidszekvenciákat feldolgoztuk, és a Seqman programmal (Lasergene DNAstar csomag) összehangoltuk őket, hogy eltávolítsuk a vektorból származó jeleket és a rossz minőségű bázisokat. Az összehangolt szekvenciákat az NCBI weboldalán található BLAST keresőprogrammal határoztuk meg, összehasonlítva a Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) és a Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu) adatbázisban reprezentált 16S rRNS gén organizmusok szekvenciáival. A filogenetikai fát a Neighbor-Joining módszerrel (Saitou & Nei, 1987) a MEGA 4.1-es verziójú programmal (Kumar et al., 2008) építettük fel. A fa topológiák megbízhatóságának becsléséhez 1000 ismétléses Bootstrap újramintavételes elemzést végeztünk. Az Aspergillus niger (FJ828924.1) ismert szekvenciáit adtuk hozzá, és azt használtuk out-csoportként.
Eredmények és megvitatás
A nitrát 42,5 óra működés után teljesen elfogyott (1. ábra). A nitrit keletkezése csökkent (2,0 mg/L 18,5 órakor) és 23,5 óra működés után következett be. 1,06 g etanol/L (36%-os fogyasztás) volt megfigyelhető 13,5 óra működés után 1650 mg/L kezdeti koncentráció mellett. A kísérlet végén az etanolfogyasztás 54%-os volt (0,77 g/L 61,5 óra alatt). Ezek az eredmények megközelítették a Gusmão et al. (2006) eredményeit. A szerzők (op.cit.) 14 órás üzemidő alatt 98,9%-os nitrátfogyasztást figyeltek meg egy baromfivágóhídról (DAKAR-Tietê SP Brazília) származó szennyvizet kezelő feláramoltató anaerob iszaptakaró (UASB) szemcsés iszapjának tisztított sejtjeivel, nitrát (350 N-NO3 mg/L), etanol (377 mg/L) és benzol (10 mg/L) mint szénforrással.
A kísérlet kezdetén metanol (197,78 mg/L) és n-butanol (23,50 mg/L) volt kimutatható. Ezek az alkoholok (metanol és n-butanol) valószínűleg jelen voltak az inokulumban. Az alkoholok koncentrációja a kísérlet végéig alig változott, ami azt jelzi, hogy ebben a denitrifikációs körülmények között nem fogytak (2. ábra).
A maximális ecetsavtermelés 16,7 mg/L volt 61,5 órás üzemidő alatt. Az STV értéke a szakaszos reaktor működésének kezdetén és végén 5,14 g/L, illetve 11,40 g/L volt, ami a biomassza 122%-os növekedését jelzi. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a szakaszos reaktorra előírt üzemeltetési feltételek kedveztek a baktériumkonzorcium denitrifikációs körülmények közötti fejlődésének és állandóságának.
Ebben a vizsgálatban a denitrifikáció folyamatát figyeltük meg, ahogyan azt más szerzők is leírták a reaktorok különböző konfigurációit használva.
Callado & Foresti (2001) háztartási szennyvizet szimuláló szintetikus szubsztráttal táplált anaerob reaktorokat működtetett a szénsavas anyag legnagyobb részének eltávolítása és a szubsztrát nitrifikáció, denitrifikáció és biológiai foszfáteltávolítás elősegítése érdekében ugyanabban a szakaszos ciklusban, egy szekvenciális anaerob/aerob/anaerob szakaszos reaktorban. A rendszert 41 napon keresztül, 84 12 órás ciklussal, 28±1 ºC hőmérsékleten működtették. A szerzők (op.cit,) megfigyelték, hogy a denitrifikáció a reakciófázisban váltakozó aerob és anoxikus körülmények között zajlott. Mindkét folyamat csak akkor zajlott le, ha az anoxikus fázis elején nátrium-acetátot (500 mg/L) adtak hozzá.
Etchebehere et al. (2001) acetátot (40 mmol/L) és glükózt (13 mmol/L) vizsgáltak szénforrásként a denitrifikációhoz egy anaerob szakaszos reaktorban kálium-nitráttal (20 mmol/L) három különböző inokulával: egy anoxikus reaktorból származó iszap (laboratóriumi méretekben), amely egy egészségügyi hulladéklerakó csurgalékvizének szén és nitrogén eltávolítására szolgált; egy malátát kezelő UASB metanogén reaktorból származó iszap és egy acetáttal és nitráttal táplált anoxikus reaktorból származó iszap. A nitrát a vizsgált három iszapmintából teljesen elfogyott, ahogyan azt a jelen vizsgálatban is megfigyelték. A szerzők (op. cit.) arra a következtetésre jutottak, hogy az acetát jobb szénforrás, mint a glükóz.
Gavazza dos Santos és munkatársai (2004) a háztartási szennyvíztisztítókból származó nitrifikált szennyvizet szimuláló szintetikus szennyvízzel táplált szakaszos reaktorokban végzett denitrifikációs folyamatot vizsgálták három elektrondonor forrással: metanol (53,3 mg/L), etanol (38,3 mg/L) és metán (a szintetikus szennyvíz mellett). A szerzők (op.cit.) megfigyelték, hogy a leghatékonyabb elektrondonor az etanol volt, amely teljesen eltávolította a nitritet és a nitrátot, ahogyan ebben a munkában is megfigyelték.
Iamamoto (2006) 84%-nál nagyobb nitrogéneltávolítást ért el egy keményítővel és ammóniummal táplált szekvenciális szakaszos reaktorban, anoxikus és aerob körülmények (2h/2h ciklusok) és 2 mg O2/L váltakozásával a következő koncentrációk esetén: 125 mg N-NH4/L és 0,95 g keményítő/L, 250 mg N-NH4/L és 1,9 g keményítő/L, 500 mg N-NH4/L és 3.8 g keményítő/l, egy szennyvíztisztító állomás (Flores da Cunha Rio Claro SP Brazília) aktív iszapos rendszeréből származó inokulummal. Szénforrásként etanolt (1500 mg/L) is teszteltünk 500 mg NH4-N/L-rel együtt. A szerzők (op.cit.) megfigyelték, hogy a nitrit és nitrát eltávolítása teljes (100%) volt, ahogy a jelen vizsgálatban is megfigyelték, ami bizonyítja az etanol denitrifikációs folyamatban való felhasználásának megvalósíthatóságát.
A denitrifikáló sejtek száma MPN szerint a szakaszos reaktor működésének kezdetén alacsonyabb volt (1,1 x 1010 MPN/mL), mint a működés végén (1,2 x 1019 MPN/mL) (3. ábra). Ezek az eredmények magasabbak, mint az alábbiakban ismertetett irodalmi adatok.
Etchebehere és munkatársai (2001) denitrifikáló sejteket számoltak meg a legvalószínűbb szám (MPN) alapján élesztőkivonattal (0,5 g/l), kálium-acetáttal (1,84 g/l) és kálium-nitráttal (0,72 g/l) kiegészített alapközegben, és 9,6 x 106 MPN/mL-t kaptak egy csurgalékvízkezelő rendszer anoxikus reaktorából származó iszappal. Callado és Foresti (2001) nátrium-acetátot használt szénforrásként egy szekvenciális anaerob/aerob/anaerob szakaszos reaktorban, és több MPN denitrifikáló baktériumot találtak a művelet elején (2,5 x 106 MPN/ml), mint a végén (3,5 x 105 MPN/ml). A szerzők (op.cit.) arra a következtetésre jutottak, hogy ez a csökkenés nem befolyásolta a denitrifikációs folyamatot.
Iamamoto (2006) ugyanezt a nagyságrendet kapta a denitrifikáló baktériumok MPN értékében egy szekvenciális szakaszos reaktor működésének végén 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 MPN/mL) és 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), mindkét esetben keményítő (1900 mg/L) mint szénforrás és egy szennyvíztisztító telepről (Rio Claro SP – Brazília) származó aktív iszapból származó inokulum hozzáadásával.
A denitrifikáló baktériumoknak kedvezett az anoxikus reaktorban előírt táplálkozási feltétel. Ez a tény megerősítette az aktív iszapból származó inokulum denitrifikációs folyamatra való képességét.
A vizsgált mintából ötven klónt nyertünk a mikrobiális konzorcium 16S rRNS génrészleteinek klónozásához és szekvenálásához. A 180 nukleotidnál kisebb értékeket tartalmazó klónokat azonban nem építettük be a filogenetikai elemzésbe, mivel nem voltak elegendőek az alább ismertetett adatbázissal való összehasonlításhoz. A klónozásból és szekvenálásból származó szekvenciákat az MPN legnagyobb hígítású pozitív mintájából (10-18) nyertük (1. táblázat).
Acinetobacter sp. azonosítottuk a következő hasonlóságokkal: 98% (1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 és 2, 4, 18, 20, 23 és 27 klónok) és 99% (6, 15, 16, 37 és 38 klónok). Gram-negatív baktérium, nem mozgékony, oxidáz-negatív, nem fermentatív, párosával, a Proteobacteria törzsbe, a Moraxellaceae családba tartozik. Fontos mikroorganizmus a talajban, ahol hozzájárulhat például az aromás vegyületek mineralizációjához (Geng et al., 2006). Wang és munkatársai (2007) Acinetobacter törzseket izoláltak egy aktivált iszapos rendszerből származó mintában (Jizhuangzi Tianjin – Kína). Ez a törzs képes volt a fenol (1,1 g/L) biológiai lebontására szabad és immobilizált sejtek segítségével. Geng és munkatársai (2006) fenolbontó baktériumokat izoláltak egy aktivált iszapkezelő rendszerből (Szingapúr) származó mintában. Biokémiai vizsgálatok kimutatták, hogy ezek a mikroorganizmusok etanol, glükóz, szacharóz és aromás vegyületek, például toluol, fenol és benzoát jelenlétében is képesek növekedni. Új fajként írták le, Acinetobacter EDP3 néven. A szerzők (op.cit.) arra a következtetésre jutottak, hogy ez a faj használható fenolos vegyületek eltávolítására vagy a fenol in situ bioremediációjára a talajban. Cai és munkatársai (2009) 58 rezisztens baktériumot azonosítottak arzénnel szennyezett talajból. Az Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas és Stenotrophomonas törzseket magas koncentrációban (20 mM Ar/L) azonosították. Az ebben a munkában azonosított Acinetobacter sp. növekedése az előírt működési körülményeknek volt köszönhető, és hozzájárulhatott a denitrifikációhoz.
A 24. és 26. klónok 98%-os, illetve 97%-os hasonlósággal hasonlítottak a Comamonas sp.-hez. A Comamonas a Proteobacteria törzsbe, a Comamonadaceae családba tartozó Gram-negatív baktériumok. Etchebehere és munkatársai (2001) Gram-negatív denitrifikáló baktériumokat izoláltak Montevideóban (Uruguay) egy hulladéklerakó csurgalékvíz kezelésére használt anoxikus reaktorból. Az izolált faj hasonlóságot mutatott a Comamonas terrigena fajjal. Ezt a mikroorganizmust azonban új fajnak tekintették, Comamonas nitrativorans néven. Gram-negatív baktériumként írták le, poláris flagellummal mozgékony, aerob és kemoorganotróf. Ez a faj etanolban, acetátban és butirátban, nitrátban, nitritben növekedett, és képes a nitrátot N2-vé redukálni.
Ezért az ebben a vizsgálatban azonosított Comamonas fajok jelen voltak az aktív iszap inokulumában, és hozzájárulhattak a vizsgálatok során bekövetkezett denitrifikációhoz.
A 25, 28, 34, 36, 42 és 65 klónok 99%-os, illetve 97%-os hasonlóságot mutattak az Acidovorax sp.-hoz (1. táblázat). Az Acidovorax sp. a Proteobacteria törzsbe tartozik; könnyen megtalálható az aktíviszapos rendszerekben. Számos Acidovorax faj az aktíviszapos rendszerekben a mikrobiológiai kezelési folyamatok szabályozó mikroorganizmusaként működik. Számos Acidovorax-fajt használnak a műanyag biológiai lebontásában és más szerves szennyező anyagok, többek között nitrofenolok, nitrobenzol és poliklórozott bifenilek denitrifikációval történő eltávolításában (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan és munkatársai (2002) denitrifikáló baktériumfajokat izoláltak, amelyek a PHBV-t (poli-3-hidroxi-butirát-co-3-hidroxi-valerát) bontják három, kommunális szennyvíz kezelésére használt aktív iszapos rendszerből (Nagoya, Osaka és Toyohashi – Japán). Az elemzett 37 klón a Betaproteobacteria osztályba tartozó szervezetekkel mutatott hasonlóságot. A legtöbb klón az Acidovorax fajjal mutatott hasonlóságot, ami megerősítette, hogy ez a faj részt vett a PHBV denitrifikáló körülmények közötti lebontásában. Gentile és munkatársai (2007) az Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium és Achromobacter fajokhoz hasonló fajokat izoláltak egy etanollal (40,0 g/L) és tejsavval (40,0 g/L) mint szénforrással működtetett denitrifikáló reaktorból; az elektrondonorokat külön-külön vizsgálták, nitrátot (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L) használtak nitrogénforrásként. A szerzők (op. cit.) arra a következtetésre jutottak, hogy a nitrát N2-vé történő teljes redukcióját az Acidovorax fajok végezték, míg az Achromobacter sp. és a Delftia acidovorans a nitrát nitritté történő nem teljes denitrifikációjáért volt felelős. Ezért az Acidovorax fajok jelen voltak az ebben a vizsgálatban elemzett mintákban, és részt vehettek a szakaszos reaktorban lezajlott denitrifikációban.
A Rhodocyclaceae családból származó, nem kultivált baktériumtörzseket 98%-os hasonlósággal azonosítottuk (9. klón – AY945917.1 és 46., 84. klón AY945905), amint az az 1. táblázatban látható. A Rhodocyclaceae család tagjai a Betaproteobacteria osztályba tartozó Gram-negatív baktériumok. Denitrifikáló aerob pálcikák, sokoldalú anyagcsere-kapacitással. A legtöbb faj vízi élőhelyeken és oligotróf talajban él. Sok közülük a szennyvízben fordul elő, és fontos szerepet játszanak az ilyen helyek biológiai szennyeződésmentesítési kezelésében (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu és munkatársai (2006) egy denitrifikáló reaktort kinolinnal (40 mg/L), egy színezékek, peszticidek és szintetikus üzemanyagok gyártása során használt toxikus aminnal, glükózzal (180 mg/L), nitráttal és kálium-foszfáttal tápláltak (C/N/P 150:30:1). Az inokulum az Industry Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japán) szennyvíztisztító rendszerének második ülepítő tartályából származott. A kinolin eltávolítása 90,2%-os volt az állandósult reaktoridőszak (6 hét) után. Az inokulum és a denitrifikáló reaktorból származó molekuláris biológiai elemzések mindkét vizsgálatban tenyésztetlen baktériumokat, Thauera és Azoarcus baktériumokat mutattak ki. A szerzők szerint az Azoarcus és Thauera baktériumokhoz tartozó klónok aránya 74% volt a denitrifikáló reaktorban és 4% az inokulumban. A környezeti mintákból származó mikroorganizmusok megismerése a tiszta kultúrákat alkalmazó laboratóriumi körülményektől függ (Pace, 1997). A különböző ökoszisztémákból származó baktériumok kevesebb mint 1%-a ismert (Amann, 1995), illetve nagyjából 99%-át nem tanulmányozták és nem azonosították. Ezért ebben a munkában arra számítottunk, hogy a nem termesztett baktériumok hasonló szekvenciáit kapjuk meg.
A kísérlet molekuláris biológiai elemzései során a konszenzusos Bacteria domain primerekkel kapott filogenetikai fát a 4. ábra szemlélteti.
A mikroorganizmusok különböző csoportjai közötti hasonlósági együtthatók 97% és 99% között voltak, és a 16S rRNS gén részleges kiértékelő szekvenciái alapján filogenetikailag rokon fajok jelenlétét jelezték. A fajok ismert szekvenciái az NCBI adatbázisából származtak, az Aspergillus niger (FJ828924.1) mint out-group szekvencia.
Ezért az ebben a vizsgálatban azonosított Acidovorax, Comamonas és Acinetobacter fajok jelen voltak a Volkswagen São Carlos Motors aktív iszap rendszerében, és részt vehettek a nitrát redukcióban és az etanol fogyasztásban.
ÖSSZEGZÉSEK
Az aktíviszapos rendszerből származó inokulum és az etanol szénforrásként való felhasználásának lehetőségét denitrifikációs folyamatban egy szakaszos reaktorban mutattuk be.
A vizsgálat során kapott MPN denitrifikáló baktérium értékek a nitrát eltávolítására vonatkozó eredményekkel együtt azt mutatták, hogy az aktíviszapos rendszerből származó inokulumban denitrifikáló baktériumok voltak, amelyeknek kedveztek az előírt táplálkozási feltételek.
Az azonosított klónok filogenetikai hovatartozása a Proteobacteria törzsbe, az Alphaproteobacteria és Gamaproteobacteria osztályba tartoztak, az Acidovorax sp, Acinetobacter sp., Comamonas sp. és kitenyésztetlen baktériumok. Ezek a baktériumok részt vehetnek a nitrát redukciójában és az etanol fogyasztásában az anoxikus szakaszos reaktorban.
MEGJELENÉSEK
A szerzők hálásan köszönik a FAPESP-től és a CNPq-től kapott támogatásokat.
APHA, AWWA és WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22. kiadás, Amerikai Közegészségügyi Szövetség, Washington, DC (2005).
Iamamoto, C. Y., Nitrogen removal in sequencing batch reactor with suspended biomass treated high ammonia concentration wastewater. Doktori értekezés, São Paulo-i Egyetem, Brazília, Mérnöki Kar, São Carlos Egyetem, Brazília (2006).
Messing, J., Új M13 vektorok klónozáshoz. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).
Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).