A kondenzátor – különböző típusok. Kontraszt a mikroszkópban
Az okulárról szóló előző cikkben rámutattam, hogy az okulár általában úgy helyezkedik el, hogy az első fókuszsíkja egybeesik az elsődleges képsíkkal (PIP). A PIP a konjugált síkok képalkotó halmazában konjugált a mintával, és így hasznos a mikroszkópos minták jellemzőinek mérésére.
Az okulár első fókuszsíkja ugyanígy konjugált az objektív hátsó fókuszsíkjával (de nem a mintával) a megvilágítási sugárnyalábban. A kondenzátor tehát egy hozzáférhető helyet biztosít, ahol a megvilágító fénysugarak manipulálásával megváltoztathatjuk vagy szabályozhatjuk a kép kontrasztját. Ez a két elv a Köhler-féle megvilágítási módszerből ered, amellyel e sorozat 3. részében foglalkoztunk.
A kondenzátor funkciója
A kondenzátor két funkciót tölt be a mikroszkópban. Egyenletesen megvilágított területet biztosít a látómezőben a minta síkjában, és az objektív apertúráját egyenletesen világítja meg elegendő, de szabályozható szögű fénnyel. Másodszor, mint már említettük, a kontraszt szabályozásának eszköze (Bradbury & Evennett, 1996). A kondenzátor legegyszerűbb formája a homorú tükör, de ez nem hasznos NA 0,2 vagy annál nagyobb objektíveknél. Ha a mikroszkópja tükörrel és távoli fényforrással rendelkezik, a tükör lapos oldalát kell használni a felszerelt alulnézetű kondenzátorral együtt. Ennek az az oka, hogy szigorúan véve a kondenzátornak párhuzamos megvilágítást kell kapnia, és így ezt a fényt a kondenzátor hátsó fókuszsíkjánál (ahol a minta található) kell fókuszba állítani.
A kondenzátor típusai
A legszélesebb körben használt kondenzortípus az Abbe-kondenzor a fénytérmikroszkópiához (1a, 1b ábra). Két vagy három lencséből épül fel, és a felső rövid fókuszú lencse általában kifordítható az optikai útból (1a), vagy kicsavarható (1b), hogy kis teljesítményű objektívekkel kitöltse a látómezőt. Ez az egyszerű megvilágító a legtöbb mikroszkópiához elegendő. Eredetileg úgy tervezték, hogy a kondenzátor elülső fókuszsíkjában excentrikusan elhelyezett nyílásból keskeny ferde fénysugarakat (vagy “ceruzákat”) biztosítson. Az 1c. ábra egy egyszerű, kétlencsés Abbe-megvilágítót mutat, amely egy alappályás készülékre van szerelve, és amely elforgatható és excentrikusan mozgatható, hogy ferde megvilágítást biztosítson. Az 1d. ábra egy kis teljesítményű kondenzátort mutat, amelyet a nagyon kis nagyítású objektívek nagy látómezejének teljes kitöltésére terveztek.
Bár a kondenzátor numerikus apertúráját meg lehet adni (gyakran 0,9 NA a száraz kondenzátoroknál és legfeljebb 1,4 NA az olaj-immersziós típusoknál), ezek az adatok nem adják meg azt az NA-t, amelyre a megvilágító sugarakat a szférikus aberráció miatt korrigálják. Sok egyszerű kondenzátorban az axiális megvilágításhoz használt tömör fénykúpot ritkán korrigálják a szférikus aberrációra 0,45 NA felett. A jó minőségű munkához és a felbontás határán lévő struktúrák felbontásához a kondenzátorokat korrigálni kell az aberrációkra. A teljesen korrigált kondenzátorok az objektívekhez hasonlóan sok lencsetagot tartalmaznak, és szinte azonos mértékben korrigálhatók. Az akromatikus-aplanatikus kondenzort (1e) mind a szférikus, mind a kromatikus aberrációra korrigálják, és a legjobb minőségű munkához, valamint a színes mikroszkópiához kell használni. Az aplanatikus kondenzátorok csak a szférikus aberrációra korrigáltak.
Az úgynevezett “univerzális” kondenzátorok (2. ábra) többfunkciósak. Ezek egy forgatható korongból állnak, amely különböző apertúramembránokat, szűrőket, foltzárakat, fázislemezeket vagy Wollaston prizmákat tart a differenciális interferencia kontraszthoz (DIC). Ez az elrendezés lehetővé teszi a kényelmes és egyszerű váltást egyik kontrasztmódszerről a másikra. A sötéttér foltzár általában csak az NA 0,5-ig vagy annál közelebbi értékig működik. Nagyobb NA objektívekkel való használathoz speciálisan kialakított sötéttér-kondenzort kell használni (3. ábra). Használatának részleteit és más kontrasztnövelő módszereket lásd Bradbury & Evennett (1996).
2. ábra. Univerzális kondenzátorok. A középső képen a felső fedelet levéve látható a forgótárcsa, amelyen az apertúra fázisgyűrűi, a DIC prizmák, a sötéttér foltzárak, a Rheinberg-korongok és a Hoffman-modulációs szűrők helyezkednek el. A legtöbb univerzális kondenzátor rendelkezik egy apertúra-irisszel a fényes térbeli munkához, több gyűrűvel a fáziskontraszthoz és egy sötéttér fékezővel a kis teljesítményű sötéttérhez.
3. ábra. Sötét-föld kondenzátorok. 3(a) Száraz sötéttér kondenzátor. 3(b) & 3(c) Olajba merülő sötétföld kondenzátorok. 3(d) Állítható olajba merülő sötéttér kondenzátor; ez a kondenzátor a különböző vastagságú tárgylemezekhez igazítható, hogy jó minőségű sötéttér-képet adjon.
Átított és visszavert fénymikroszkópia
Az átmenő fénymikroszkóp elrendezése külön kondenzátort igényel, mivel a fény először a mintadarabra sűrűsödik (ahol a fény kölcsönhatásba lép az anyaggal), majd az optikai tengely mentén tovább haladva az objektívvel összegyűjti.
A visszavert fénymikroszkópban más a helyzet. Itt a sugárút a minta tengelye körül meghajlik, ahol a fény visszaverődik a felületéről. Az objektív saját kondenzorként működik, és a visszavert fényű mikroszkóp igazítása nagyon leegyszerűsödik (lásd a sugárdiagramokat e sorozat 2. részében). Az objektív hátsó fókuszsíkjához azonban nehéz hozzáférni (elülső fókuszsík, ha kondenzorként használják), ezért kiegészítő lencséket használnak, hogy olyan helyzetet hozzanak létre, amelyben a rekeszek és szűrők képe a hátsó fókuszsíkkal konjugált.
A beesőfényes rendszer nagyon hasznos a fluoreszcens mikroszkópiához, főként azért, mert a minta megvilágítása egyszerű, hatékonyabb (nagy nagy nagyításoknál világosabb képeket ad) és más kontrasztmódszerekkel kombinálható átmenőfénnyel.
4. ábra. A visszavert fényű mikroszkópiához használt epi-illuminátor illusztrációja
Ez az epi-illuminátor kétféle visszavert fényű objektívvel van felszerelve az orrnyeregbe. A használatban lévő objektívet sötét talaj megvilágítására tervezték, míg a másik két objektív, amely látható, fényes térben végzett visszavert fényű munkára szolgál. Az utóbbi két objektív körüli széles gallér biztosítja az objektív optikai tengelyre való centrálását. Az epi-illuminátor burkolatán található “D” jelöli a cserélhető betétet, amely lehetővé teszi a készülék sötétmezős megvilágításhoz való használatát. Ez sík tükörre cserélhető a fényes térben végzett reflektált fénymikroszkópiához. Az átmenőfény-kondenzort eltávolították az asztal alól.
Ha az objektív saját kondenzorként működik a reflektáltfény-mikroszkópiában, miért nem használják az objektíveket az átmenőfény-mikroszkópia megvilágítására is? Eltekintve az objektív hátsó fókuszsíkjához való hozzáférés gyakorlati nehézségeitől, az objektívek többfunkciós felhasználása nehézkes, és a megvilágítás szöge általában nem szabályozható (az objektív hátsó fókuszsíkjában lévő íriszmembránnal).
A kontrasztnövelés alapelvei
A mikroszkóp által felbontott kép részleteinek érzékeléséhez elegendő láthatóságra, azaz kontrasztra van szükségünk. Fontos a szelektivitás: legalább néhány regionális különbségre van szükségünk a tárgyon belül, valamint a tárgy és a háttér között, hogy felismerjük a részleteket.
A kontrasztot a képen három eszközzel nyerjük, külön-külön vagy együttesen. Ezek:
- a tárgy és a fény kölcsönhatása,
- a megvilágítás manipulálása, és
- a képrögzítő közeg manipulálása.
A c) részben szereplő kontraszt módosítása fényképészeti fejlesztéssel és/vagy nyomtatással, valamint az analóg video- vagy digitális képek elektronikus kontrasztosításával is elérhető. A kondenzátor azonban az a) és b) részben a kép kontrasztjának és láthatóságának manipulálásában játszik szerepet. A fénymikroszkópia kontraszttechnikáinak elméleti és gyakorlati vonatkozásairól további részleteket találhatunk Bradbury & Evennett, 1996 és Sanderson, 2002, 2000, 1998 és 1994 munkáiban. Röviden, a kontraszt előállításának legismertebb formái a fényes tér, a ferde megvilágítás, a sötét talaj & Rheinberg, a fáziskontraszt és a DIC. Lehetőség van arra is, hogy ezeket a módszereket különböző megvilágítási formákkal kombináljuk (pl. polarizált fény Rheinberggel, vagy fáziskontraszt átvitt fényes térrel, beeső fluoreszcenciával). Mivel a kontrasztnövelés nagymértékben a mikroszkópos szakember ellenőrzése alatt áll, nem lehet eléggé hangsúlyozni a kondenzátor megfelelő használatának fontosságát.
A legjobb minőségű kép elérése érdekében a kondenzort megfelelően kell fókuszálni (lásd 3. rész, A mikroszkóp beállítása Köhler-megvilágításhoz). Ez a kontrasztnövelés bármilyen módszerét (fénymező, fázis, sötét alap) alkalmazzuk is. Fényes térmikroszkópiában a fókuszálatlan kondenzátor legnyilvánvalóbb hatása a felbontóképesség jelentős csökkenése, ami viszont “romlott” képet eredményez, a kép minden egyes pontja körül diffrakciós glóriákkal. Ugyanez az eredmény következik be, ha a felső (rövid fókuszú) lencsét kihagyják vagy kifordítva hagyják, amikor nagy teljesítményű objektívet használnak, és az objektív hátsó fókuszsíkját nem töltik ki teljesen fénnyel.
Ha a fáziskontraszt-mikroszkópiát rosszul fókuszált kondenzátorral kísérlik meg, a kondenzátorban lévő gyűrű gyakran nem felel meg az objektív hátsó fókuszsíkjában lévő fázisgyűrű átmérőjének, és minden kontrasztjavulás elvész. A kondenzátor fókuszálásának problémái szintén rossz sötéttér-mikroszkópiát eredményezhetnek, ha a foltzár képe nem takarja el teljesen az objektívből érkező közvetlen megvilágítást. A sorozat következő részében visszatérünk az objektívre, és megvizsgáljuk a tubushosszat, valamint azt, hogyan határozzuk meg az objektívek fókusztávolságát, nagyítását, apertúráját és egyéb paramétereit.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (szerk.). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (4 kötetes sorozat) 0-12-164725-0; csak a 3. kötet = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.