Unterschiedliche Auswirkungen auf die Membrandurchlässigkeit und Lebensfähigkeit menschlicher Keratinozyten, die Megaschallfeldern sehr niedriger Intensität ausgesetzt sind

Die Auswirkungen der Exposition mit US sehr niedriger Intensität (Ispta zwischen 7 und 16 mW/cm2, deutlich unter der Kavitationsschwelle, 100 mW/cm2) mit einer Frequenz von 1 MHz wurden an HaCaT-Zellen untersucht. Die Experimente wurden mit einem äquivalenten medizinischen Aufbau durchgeführt, der in Abbildung S1 von ESI skizziert ist, und variierten die Behandlungsparameter wie Ispta, Arbeitszyklus und Beschallungszeit. Vorläufige Experimente zeigten, dass die Temperatur im Bereich der hier verwendeten Expositionsparameter konstant blieb (innerhalb von 1 °C), abgesehen von der thermischen Dissipation der US-Energie. Außerdem zeigten die Behandlungen keine signifikante Abhängigkeit der untersuchten Wirkungen vom US-Wellentastverhältnis. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit der geringen US-Absorption bei 1 MHz; im Gegenteil, thermische Effekte und das Tastverhältnis könnten sich auf Zellen und Gewebe auswirken, die höheren Frequenzen ausgesetzt sind, da der US-Dämpfungskoeffizient proportional zur Frequenz ist23,31.

Die Ergebnisse werden zunächst unter Berücksichtigung der beiden relevanten Expositionsparameter, Beschallungszeit und Ispta, getrennt dargestellt. Die strukturellen und physikalischen Veränderungen der Zellmembran (Permeabilität, Aufnahmeeffizienz und maximale Größe der internalisierten Moleküle) werden analysiert und mit den entsprechenden zytotoxischen Schäden und der möglichen Aktivierung von Entzündungsmustern korreliert. Anschließend werden die Ergebnisse in Bezug auf die Beschallungsdosis interpretiert, die als das Produkt aus Ispta und Einwirkungszeit definiert ist, d. h. die Oberflächendichte der Schallenergie, die während der Beschallung auf die Probe trifft. Tatsächlich hängen die untersuchten Phänomene von dieser Größe ab, und dies ermöglichte es uns, einen Bereich von Expositionsparametern zu identifizieren, in dem ein vorübergehender SP mit vernachlässigbaren biologischen Schäden auftritt.

Analyse des Einflusses der US-Expositionszeit

Veränderungen in der Membranpermeabilität von HaCaT-Zellen, die durch 1-MHz-US mit niedriger Intensität induziert werden, wurden in Bezug auf die Aufnahmeeffizienz der grün fluoreszierenden Sonde Calcein geschätzt. Da intakte Membranen für Calcein undurchlässig sind, ist es ein zuverlässiger Marker für SP. Der Prozentsatz der grün-positiven Zellen wurde mit Hilfe von Durchflusszytometrie-Analysen gemäß Abschnitt 2.5 quantifiziert.

Um die Empfindlichkeit der Membranpermeabilität gegenüber der US-Expositionszeit zu bewerten, wurde eine sehr niedrige US Ispta verwendet. Bemerkenswert ist, dass bereits ein Ispta von 7 ± 1 mW/cm2 signifikante Effekte auf die Membranpermeabilität durch geeignete Expositionszeiten ausgelöst werden können. Repräsentative Ergebnisse paralleler durchflusszytometrischer Untersuchungen an HaCaT- und NIH-3T3-Zellen, die beide bei Ispta ~7 mW/cm2 für 5′, 15′, 30′ und 45′ beschallt wurden, sind in Abb. 1 dargestellt (rote Dreiecke bzw. blaue Quadrate). Der Vergleich zwischen den Zelllinien nach niedrigen Beschallungszeiten (unterhalb der Schwelle der Sonoporation) ergibt erwartungsgemäß eine geringe Affinität von Calcein, wobei die Unterschiede (die größten bei HaCaT-Zellen) auf die jeweilige Membranzusammensetzung und Permeabilität zurückzuführen sein dürften. Wichtiger ist, dass beide Zelllinien einen signifikanten Anstieg der Aufnahmeeffizienz ab einer Expositionsdauer von 15′ zeigen, was einer Beschallungsdosis von (6,3 ± 0,9) J/cm2 entspricht, was auf die Aktivierung des SP-Prozesses hindeutet. Nach den besten Anpassungen von Abb. 1 weisen unsere Experimente bei längeren Expositionszeiten auf eine lineare Korrelation zwischen der Aufnahmeeffizienz und der Expositionszeit hin, wobei die durch US induzierte Aufnahmerate sowohl bei HaCaT- als auch bei NIH-3T3-Zellen identisch ist (lineare Regressionssteigungen (%/min) 1,3 ± 0,2 bzw. 1,4 ± 0,2 für HaCaT und NIH-3T3). Dies würde bedeuten, dass die Erhöhung der Aufnahmeeffizienz durch SP ein zelllinienunabhängiges Phänomen ist.

Um den SP-Prozess weiter zu untersuchen und die Internalisierung zu charakterisieren, wurden die behandelten HaCaT-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Durchflusszytometrie zeigen Proben, die für 5′ beschallt wurden, keine signifikante Veränderung der Membranpermeabilität im Vergleich zur Kontrollprobe (unbehandelt), während ab 15′ eine zunehmende Aufnahmeeffizienz zu beobachten ist (wie in Abb. 2 und Abbildung S2 in ESI gezeigt), obwohl nicht alle Zellen Fluoreszenz zeigten. Dementsprechend erscheinen die Zellen im Vergleich zur Kontrollprobe weniger dicht und adhärent, was auf eine Lockerung der tight-junctions schließen lässt. Die repräsentativen Bilder in Abb. 2 deuten auf eine heterogene Lokalisierung des Calceins innerhalb der Zellen hin, und in der Tat konnte mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie innerhalb der HaCaT-Zellen die periphere Verteilung der Sonde deutlich von der internen unterschieden werden (siehe Bild und 3D-Rekonstruktionen in Abb. 3). Weitere detaillierte Bilder sind in Abschnitt 3 von ESI zu sehen. Die Beobachtungen stimmen mit einer zweistufigen Aufnahme der Fluorsonde überein: eine periphere, bei der die Sonde im Netzwerk des endoplasmatischen Retikulums um die Plasmamembran herum lokalisiert ist; die andere, die deutlich nach 30′ Exposition zu sehen ist, bei der die Diffusion der Sonde in das Zytoplasma eine intensive Fluoreszenz verursacht, die gleichmäßig über die gesamte Zelle, einschließlich des Nukleoplasmas, verteilt ist. Es sei darauf hingewiesen, dass der Stokes-Durchmesser von Calcein ~1,36 nm beträgt und sein intranukleärer Transport nicht durch Diffusionsbarrieren behindert wird29. Eine umfassendere Analyse, über die in den Abschnitten 3.2 und 3.3 berichtet wird, lässt den Schluss zu, dass die US-Expositionsdosis und das Molekulargewicht der Sonde die dominierenden Faktoren bei der Bestimmung der Aufnahme waren.

Ein weiterer Test auf der Grundlage der roten PI-Fluorsonde wurde durchgeführt, um die Wiederherstellung der nativen Membranpermeabilität von beschallten Zellen zu bewerten (siehe auch Abschnitt 2.3). Die Internalisierung von PI weist auf die Aktivierung zytotoxischer Prozesse hin. Die Ko-Lokalisierung des grünen und des roten Farbstoffs innerhalb der Zellen deutet daher auf ein Scheitern des Membranerholungsprozesses nach SP hin. Andererseits weist die Beobachtung der grünen Fluoreszenz in den Zellen in Abwesenheit der roten Fluoreszenz auf das Auftreten von Membran-SP während der US-Behandlung und deren erfolgreiche Erholung nach dem Abschalten des Feldes hin. Repräsentative konfokale Fluoreszenzbilder sind in Abb. 4 dargestellt. Die Ko-Lokalisierung der beiden Farbstoffe ist in den für 15′ behandelten Zellen nicht vorhanden, während sie nach 30′ der Exposition kaum noch zu beobachten ist (Abbildung S5 in ESI). Dementsprechend wurde ein Nettoverlust der Lebensfähigkeit von ~5 % festgestellt, wie durchflusszytometrisch überprüft. Bei den Zellen, die 45′ lang beschallt wurden, was einer Dosis von (19 ± 3) J/cm2 entspricht, ist die Ko-Lokalisierung deutlicher zu erkennen (siehe weiße Pfeile in Abb. 4B), und es tritt ein signifikanterer Verlust an Lebensfähigkeit auf (~10 %, wie durchflusszytometrisch geprüft). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine längere Expositionszeit, die einer höheren Dosis bei festem Ispta entspricht, eine irreversible Veränderung der Membranstruktur und eine daraus folgende zytotoxische Reaktion hervorruft.

Analyse des Einflusses der US-Intensität

Die Auswirkung der unterschiedlichen Intensität des angelegten US-Feldes auf die Membranpermeabilität wurde an der HaCaT-Zelllinie nach 15′ Exposition analysiert, kurz genug, um Effekte auszuschließen, die durch eine lang anhaltende Beschallung induziert werden. In unserer Studie lagen die US-Intensitäten im Bereich zwischen Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 und Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, also deutlich unterhalb der Kavitationsschwelle24. Gemäß dem in den Abschnitten 2.3 und 2.5 beschriebenen Protokoll wurden FITC-markierte Dextrane mit unterschiedlichem MW (MW = 10, 40 und 70 kDa) verwendet, um für jede US-Intensität die Induktion der Membranpermeabilität für die verschiedenen Molekülgrößen zu charakterisieren. Dieses Verfahren ermöglicht es wiederum, die Größe der Sonopore zu bewerten. Ähnlich wie Calcein dringen Dextrane nicht signifikant in unbehandelte Zellen ein31,32, während die Zellaufnahme von FITC-markierten Dextranen bei Kavitations-US sowohl durch SP als auch durch die Förderung des Endosomen-Traffics stark erhöht werden kann30. In diesem Zusammenhang zeigen die in Abb. 5 dargestellten Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen eindeutig eine größenabhängige Aufnahme, ein Phänomen, das es uns erlaubt, die Gleichzeitigkeit aktiver Endozytoseeffekte auszuschließen, und das gemäß der Literatur22 darauf hindeutet, dass die durch niedrige Intensität ausgelöste SP der Hauptmechanismus für den Transport von Dextranmolekülen durch die Plasmamembran ist. Insbesondere ist die beobachtete SP-induzierte Aufnahme durch einen Schwellenwert Ispta gekennzeichnet, der linear mit dem Anstieg des MW der internalisierten Moleküle zunimmt. Unterhalb dieses Schwellenwerts ist die Aufnahmeeffizienz der behandelten Zellen mit derjenigen der nicht exponierten Zellen vergleichbar. Die Ispta-Schwellenwerte sind in Tabelle 1 aufgeführt. Bei Intensitäten oberhalb des Schwellenwerts nimmt die Aufnahmeeffizienz mit der Zunahme von Ispta zu, bis ein Maximum erreicht wird. Für das 10 kDa Dextran nimmt sie dann leicht ab und erreicht ein Plateau. Der beobachtete Rückgang der Aufnahmeeffizienz bei hohen Intensitäten lässt sich durch die Zunahme der Zahl der toten Zellen erklären, die beim Spülen aus der Probe entfernt werden und somit nicht zu den durchflusszytometrischen Analysen beitragen. Außerdem könnte die Aktivierung von apoptotischen Prozessen die Internalisierung des Farbstoffs behindern. Bemerkenswert ist, dass die Zellen bei Ispta = 15 mW/cm2, obwohl dieser Wert weit unter der Kavitationsschwelle liegt, in der Lage sind, 70 kDa Dextrans mit einem Stokes-Durchmesser von ~12 nm zu internalisieren. Dieser Wert kann als Schätzwert für die Mindestgröße der in der Membran erzeugten Sonoporen angesehen werden. In Abbildung S6 (Abschnitt 4 der ESI) ist eine Reihe von repräsentativen Fluoreszenzbildern dargestellt, die die Dextrans-Aufnahme bei der Schwelle Ispta zusammen mit dem PI-Test zeigen.

Die Internalisierung von PI zeigt eine signifikante zytotoxische Reaktion bei Ispta = 15 mW/cm2 (Expositionsdosis 13,5 J/cm2). Wie von Udroiu et al.13 unter ähnlichen experimentellen Bedingungen berichtet, wurde auch bei NIH-3T3-Zellen ein leichter, aber signifikanter Anstieg der Inzidenz von Mikrokernen beobachtet, abhängig von der Intensität und der Dauer der Exposition mit 1 MHz US. Diese Beobachtungen legten nahe, dass weitere Studien erforderlich sind, um die biologischen Wirkungen, die mit der Membran-SP einhergehen, besser zu verstehen, und deshalb wurde eine Studie der biologischen Reaktion von beschallten Zellen in Abhängigkeit von der US-Intensität durchgeführt.

Die biologische Reaktion auf die SP-induzierten „Membranwunden“, die durch sehr niedrige US-Intensitäten hervorgerufen werden, wurde gründlich charakterisiert, indem der Zelltod unter Verwendung des in Abschnitt 2.5 beschriebenen kombinierten AnnexinV- und PI-Tests bewertet wurde (siehe auch Abschnitt 5 der ESI). Wir haben auch die Expression des Gens IL-6, eines Zytokins, das chronische Entzündungen mit Krebs in Verbindung bringt, bewertet33,34. Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse, ausgedrückt als prozentualer Zellanteil, sind in Abb. 6 dargestellt. Die Lebensfähigkeit der Zellen bleibt während der 15′-Behandlungen größtenteils erhalten (>90%), jedoch tritt ab Ispta = 9 mW/cm2 ein leichter Rückgang ein, begleitet von einer Zunahme der früh apoptotischen Zellen. Bei Ispta = 14 mW/cm2 wird ein signifikanter Prozentsatz nekrotischer Zellen beobachtet, während bei Ispta = 16 mW/cm2 auch die späte Apoptose zum Zelltod beiträgt, entsprechend einer leichten Abnahme der Nekrose (repräsentative durchflusszytometrische Punktdiagramme in Abbildung S7 von ESI). Die IL-6-Genexpression wurde mittels RT-PCR bestimmt (Abb. 7). Für Ispta ≤15 mW/cm2 wurde keine Hochregulierung beobachtet, während die Behandlung mit 16 mW/cm2 eine Überexpression dieses Gens im Vergleich zu den unbehandelten Zellen induzierte.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch US verursachte Membranschädigung ab einem Ispta-Schwellenwert von 16 mW/cm2 und 15′ Beschallung nicht nur die Lebensfähigkeit der Zellen verringert, sondern durch die Überexpression des entzündungsbezogenen Gens IL-6 auch eine Entzündungsreaktion auslösen könnte. Da in mehreren Untersuchungen eine Rolle der Entzündung bei der Pathogenese und dem Fortschreiten von Krankheiten wie Krebs erkannt wurde35,36 , sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die mit den Entzündungsmustern verbundenen Aspekte besser zu charakterisieren.

Analyse des Einflusses der Beschallungsdosis

Um die Beziehung zwischen dem angelegten US-Feld und den beobachteten biologischen Wirkungen im Hinblick auf die den Zellen während der Exposition zugeführte Energie quantitativ zu analysieren, wurde die Beschallungsdosis für jede Behandlung als Produkt der Intensität Ispta durch die Expositionszeit berechnet. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 2 aufgeführt, wobei die beobachteten biologischen Wirkungen durch Hintergrundfarben gekennzeichnet sind. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Membran-SP ab einer Schwellendosis von etwa 6,3 J/cm2 auftritt. Außerdem kann die Größe der Sonoporen mit der Beschallungsdosis in Verbindung gebracht werden. Bei einer Dosis von mehr als 10,8 J/cm2 werden in den behandelten Zellen eine Abnahme der Lebensfähigkeit und gleichzeitig eine frühe Apoptose beobachtet, gefolgt von einer späten Apoptose, Nekrose und einer Überexpression von IL-6 ab 14,4 J/cm2.

Wir möchten betonen, dass diese Dosis und Ispta 16 mW/cm2 einem negativen Spitzendruck von ~0,02 MPa entspricht. Dieser Wert scheint hoch genug zu sein, um mechanischen Stress an der Plasmamembran/Wasser-Grenzfläche zu induzieren, obwohl er eine Größenordnung unter dem bisher vorgeschlagenen Schwellenwert für die Sicherheitsexposition liegt (mechanischer Index ~0,2-0,3, bei 1 MHz).

Wir möchten darauf hinweisen, dass unsere Experimente erfolgreich mit denen verglichen wurden, die mit einem elektromedizinischen System durchgeführt wurden, das tatsächlich in der US-Therapie eingesetzt wird (siehe auch Abschnitt 2.2), was die medizinische Relevanz unseres Ansatzes unterstreicht. In dieser Hinsicht sind wir zuversichtlich, dass die Bereitstellung von Informationen über die Beschallungsdosis (bei fester US-Frequenz) einen vollständigeren Index für die Charakterisierung der Zellreaktion auf die US-Exposition und im Gegenzug eine feine Identifizierung einer Reihe von Parametern ermöglicht, bei denen transiente SP mit vernachlässigbaren biologischen Schäden auftreten.

Ein sehr wichtiger Schritt zum Verständnis der biologischen Auswirkungen unserer Ergebnisse in vivo wäre die Durchführung von US-Expositionen an dreidimensionalen Biosystemen, wie menschlichem Gewebe, das aus mehrfach gestapelten Cheratinozyten oder Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke besteht.