Stammzellen aus Fruchtwasser und Amnionmembran: Marker Discovery

Abstract

Amnionflüssigkeit (AF) und Amnionmembran (AM) wurden kürzlich als vielversprechende Quellen für Stamm- oder Vorläuferzellen charakterisiert. Beide enthalten nicht nur Subpopulationen mit Stammzellcharakteristika, die adulten Stammzellen ähneln, wie z. B. mesenchymale Stammzellen, sondern weisen auch einige Eigenschaften embryonaler Stammzellen auf, wie (i) Expression von Pluripotenzmarkern, (ii) hohe Expansion in vitro oder (iii) Fähigkeit zur Differenzierung in mehrere Zelllinien. In jüngster Zeit hat man sich auf die Isolierung und detaillierte Charakterisierung dieser Stammzelltypen konzentriert. Die Variationen in ihrem Phänotyp, ihre von verschiedenen Gruppen beschriebene Heterogenität und das Fehlen eines einzigen Markers, der nur in diesen Zellen exprimiert wird, können jedoch die Isolierung einer reinen homogenen Stammzellpopulation aus diesen Quellen und die potenzielle Verwendung dieser Zellen in therapeutischen Anwendungen verhindern. In diesem Beitrag wollen wir die jüngsten Fortschritte bei der Entdeckung von Markern für Stammzellen aus fötalen Quellen wie AF und AM zusammenfassen, wobei neue Methoden auf der Grundlage von Transkriptomik, Proteomik oder Sekretomanalysen eingesetzt werden.

1. Einleitung

Sowohl Fruchtwasser (AF) als auch Amnionmembran (AM) stellen reichhaltige Quellen von Stammzellen dar, die in Zukunft für klinische therapeutische Anwendungen genutzt werden können. Ethische Bedenken hinsichtlich der Isolierung von Stammzellen aus diesen Quellen sind im Gegensatz zu den Problemen, die bei der Erforschung menschlicher embryonaler Stammzellen (ESC) auftreten, minimal. Fruchtwasser wird bei planmäßigen Fruchtwasseruntersuchungen zwischen der 15. und 19. Schwangerschaftswoche für die Pränataldiagnose entnommen, und die überschüssige Probe kann für die Zellgewinnung verwendet werden, wohingegen Fruchtwasser in der Regel bei Kaiserschnitten von Terminschwangerschaften entnommen wird. Angesichts der Heterogenität der aus diesen Quellen stammenden Stammzellpopulationen ist die Isolierung bestimmter Zelltypen schwierig und erfordert eine detaillierte phänotypische und molekulare Charakterisierung der jeweiligen Zellen. Studien, die „omics“-Ansätze beinhalten, sind von grundlegender Bedeutung, um die Mechanismen der molekularen Expression dieser Zellen besser zu verstehen und die richtigen Methoden für ihre Isolierung zu definieren, bevor sie in therapeutischen Ansätzen verwendet werden.

Dieser Artikel zielt darauf ab, die wichtigsten biologischen und molekularen Eigenschaften von AF- und AM-abgeleiteten Stammzellen vorzustellen und auch die jüngsten Fortschritte bei der Entdeckung von Markern unter Verwendung globaler Methoden, wie Transkriptomik, Proteomik oder Sekretomanalysen, hervorzuheben.

1.1. Fruchtwasser

AF dient als schützende Flüssigkeit für den sich entwickelnden Embryo und bietet mechanische Unterstützung und die erforderlichen Nährstoffe während der Embryogenese. Die Fruchtwasseruntersuchung wird seit vielen Jahrzehnten als Routineverfahren für die fetale Karyotypisierung und die pränatale Diagnostik eingesetzt und ermöglicht die Erkennung einer Vielzahl genetischer Erkrankungen.

Der Hauptbestandteil des Fruchtwassers ist Wasser; seine Gesamtzusammensetzung variiert jedoch während der Schwangerschaft. Zu Beginn der Schwangerschaft ist die Osmolarität des Fruchtwassers ähnlich wie die des fetalen Plasmas. Nach der Keratinisierung der fetalen Haut nimmt die Osmolarität des Fruchtwassers im Vergleich zum mütterlichen oder fetalen Plasma ab, was hauptsächlich auf den Zufluss von fetalem Urin zurückzuführen ist. Interessanterweise stellt das Fruchtwasser auch eine reiche Quelle für eine Stammzellenpopulation dar, die entweder vom Fötus oder von der umgebenden Amnionmembran stammt. Weitere Untersuchungen verschiedener Gruppen haben sich in letzter Zeit auf die zellulären Eigenschaften von Zellen aus dem Fruchtwasser und ihre mögliche Verwendung in präklinischen Modellen und in Transplantationstherapien konzentriert.

1.1.1. Amnionwasser-Stammzellen (AFSCs)

Die Amnionwasserzellen (AFCs) stellen eine heterogene Population dar, die aus den drei Keimschichten stammt. Diese Zellen haben einen epithelialen Ursprung und stammen entweder aus dem sich entwickelnden Embryo oder von der inneren Oberfläche der Amnionmembran, die als Amnionmembran-Stammzellen bezeichnet werden. Die AFCs bestehen hauptsächlich aus drei Gruppen von adhärenten Zellen, die anhand ihrer morphologischen, wachstumsbedingten und biochemischen Merkmale kategorisiert werden. Epitheloide Zellen (E-Typ) sind quaderförmige bis säulenförmige Zellen, die aus der fetalen Haut und dem Urin stammen, Zellen aus Fruchtwasser (AF-Typ) stammen aus fetalen Membranen, und fibroblastische Zellen (F-Typ) entstehen hauptsächlich aus fibrösem Bindegewebe. Sowohl AF- als auch F-Typ-Zellen weisen eine fibroblastoide Morphologie auf, und der dominierende Zelltyp scheint der AF-Typ zu sein, der Keratine und Vimentine mitexprimiert. Mehrere Studien haben gezeigt, dass menschliche Fruchtwasserstammzellen (AFSC) leicht aus einer kleinen Menge von Fruchtwasser aus dem zweiten Trimester gewonnen werden können, das bei Routine-Amniozentesen entnommen wird, einem Verfahren mit einer Spontanabortrate von 0,06 bis 0,5 %. Bislang wurde über eine Reihe unterschiedlicher Kultivierungsprotokolle berichtet, die zu angereicherten Stammzellpopulationen führen. Die Isolierung von AFSC und die jeweiligen Kultivierungsprotokolle wurden in einer kürzlich erschienenen Übersichtsarbeit von Klemmt et al. zusammengefasst und können wie folgt kategorisiert werden: (i) ein einstufiges Kultivierungsprotokoll, bei dem die Primärkultur 7 Tage oder länger ungestört gelassen wurde, bis die ersten Kolonien erschienen, (ii) ein zweistufiges Kultivierungsprotokoll, bei dem Amniozyten, die nach 5 Tagen in der Kultur nicht angeheftet waren, gesammelt und weiter expandiert wurden, (iii) Zelloberflächenmarker-Selektion für CD117 (c-kit-Rezeptor), (iv) mechanische Isolierung der anfänglichen mesenchymalen Vorläuferzellkolonien, die sich in den Anfangskulturen gebildet hatten, und (v) Kurzzeitkulturen zur Isolierung von fibroblastoiden Kolonien. Die meisten der nach diesen Methoden isolierten AFSC wiesen einen multipotenten mesenchymalen Phänotyp auf und zeigten im Vergleich zu adulten MSC ein höheres Proliferationspotenzial und ein breiteres Differenzierungspotenzial.

1.2. Amnionmembran (AM)

Die Amnionmembran, der jegliches Gefäßgewebe fehlt, bildet den größten Teil der inneren Schicht der fetalen Membran und besteht aus drei Schichten: (i) einer epithelialen Monoschicht, die aus Epithelzellen besteht, (ii) einer azellulären intermediären Basalschicht und (iii) einer äußeren mesenchymalen Zellschicht, die reich an mesenchymalen Stammzellen ist und in unmittelbarer Nähe zum Chorion liegt. AM wurde jahrzehntelang in der Klinik zur Wundheilung bei Verbrennungen, zur Förderung der Epithelbildung und zum Schutz vor Infektionen eingesetzt. In jüngster Zeit wurde die Verwendung von AM als Wundverband bei chirurgischen Defekten der Mundschleimhaut, bei der Rekonstruktion der Augenoberfläche, bei Hornhautperforationen und bei der Vergrößerung der Blase untersucht.

1.2.1. Amnionmembran-Stammzellen (AMSCs)

Amnionmembran-Stammzellen (AMSCs) umfassen zwei Typen, die Amnion-Epithelzellen (AECs) und die Amnionmembran-Mesenchym-Stammzellen (AM-MSCs), die aus der Amnion-Epithel- bzw. der Amnion-Mesenchymschicht stammen. Beide Zelltypen entstehen in der Prägastrulationsphase des sich entwickelnden Embryos, vor der Abgrenzung der drei primären Keimschichten, und sind meist epithelialer Natur. Für die Isolierung von AECs und AM-MSCs wurden verschiedene Protokolle entwickelt, die in erster Linie auf der mechanischen Abtrennung der AM von der Chorionmembran und dem anschließenden enzymatischen Aufschluss basieren. AM-MSCs zeigten eine plastische Adhärenz und eine fibroblastoide Morphologie, während AECs einen kopfsteinpflasterartigen Epithelphänotyp aufwiesen. AM-MSCs wiesen ähnliche phänotypische Merkmale auf wie solche, die aus adulten Quellen stammen. Interessanterweise zeigten AM-MSCs, ähnlich wie AF-MSCs, eine höhere Proliferationsrate im Vergleich zu MSCs aus adulten Quellen und ein mehrstufiges Differenzierungspotenzial in Zellen aus den drei Keimschichten.

2. Immunophänotyp

2.1. Stammzellen aus Fruchtwasser

Das Fruchtwasser hat sich in letzter Zeit als alternative fetale Quelle für eine Vielzahl von Stammzellen erwiesen. In diesem Artikel wollen wir die wichtigsten Merkmale von AFSCs zusammenfassen. Bislang sind die MSCs die am besten charakterisierte Subpopulation der AFSCs. Die AF-MSCs wiesen eine typische Expression mesenchymaler Marker auf, wie z. B. CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 und CD44, die mittels durchflusszytometrischer Analysen bestimmt wurden. Darüber hinaus exprimierten diese Zellen die HLA-ABC-Antigene, während die Expression der hämatopoetischen Marker CD34 und CD45, des Endothelmarkers CD31 und des HLA-DR-Antigens nicht nachweisbar war. Noch wichtiger ist, dass die Mehrheit der kultivierten AF-MSCs Pluripotenzmarker wie das Octamer-Bindungsprotein 3/4 (Oct-3/4), den Homebox-Transkriptionsfaktor Nanog (Nanog) und das stadienspezifische embryonale Antigen 4 (SSEA-4) exprimierte.

Es wurde auch berichtet, dass Amniozytenkulturen eine kleine Population von CD117-positiven Zellen enthalten (eine Tyrosinkinase, die spezifisch für den Stammzellfaktor ist, der hauptsächlich in ESCs und primordialen Keimzellen vorkommt), die in der Kultur klonal expandiert werden können. Die Differenzierungseigenschaften von CD117+ AFS wurden zum ersten Mal in vivo getestet, wodurch ihre Stammzellidentität nachgewiesen werden konnte. Experimentelle Beweise deuten darauf hin, dass AFSCs von spindelförmigen fibroblastoiden Zellen abstammen.

In einem Versuch, die Subpopulationen der AFSCs zu analysieren, hat unsere Gruppe kürzlich zwei morphologisch unterschiedliche Populationen von AFSCs mesenchymalen Ursprungs identifiziert, die unterschiedliche Proliferations- und Differenzierungseigenschaften aufweisen und als spindelförmig (SS) und rund (RS) bezeichnet werden. Beide Subpopulationen exprimieren mesenchymale Stammzellmarker in ähnlichem Ausmaß. Es wurde jedoch festgestellt, dass SS-Kolonien im Vergleich zu RS-Kolonien mehr CD90- und CD44-Antigene exprimierten.

2.2. Amnionmembran-Stammzellen (AMSCs)

Eine detaillierte Immunphänotyp-Analyse der AMSCs ergab die Expression von Antigenen wie CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , Stromastammzellmarker 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, Kollagen I und III (Col1/Col3), alpha-glattes Muskelaktin (α-SMA), CD44, Vimentin (Vim), Fibroblastenoberflächenprotein (FSP) und HLA-ABC-Antigen. Das interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) wurde jedoch nur in sehr geringem Maße exprimiert, und die Proteine TRA-1-60, vaskuläres Zelladhäsionsprotein 1 (VCAM-1), von Willebrand-Faktor (vWF), Plättchen-Endothelzellen-Adhäsionsmolekül (PECAM-1), CD3 und HLA-DR wurden nicht nachgewiesen. Eines der am häufigsten vorkommenden Proteine in AM-abgeleiteten Zellen ist Laminin, das eine Schlüsselrolle bei der Differenzierung, Zellform und -migration sowie der Geweberegeneration spielt. RT-PCR-Analysen zeigten außerdem, dass AMSCs Gene wie Oct-3/4, Zinkfingerprotein 42 (zfp42 oder Rex-1), Stammzellfaktorprotein (SCF), Neuronales Zelladhäsionsmolekül (NCAM), Nestin (NES), Knochenmorphogenetisches Protein 4 (BMP-4), GATA-Bindungsprotein 4 (GATA-4) und Hepatozytenkernfaktor 4α (HNF-4α) auch in hohen Passagen exprimieren. Die Transkripte von Brachyury, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 5 (FGF5), Paired-Box-Protein (Pax-6) und Knochenmorphogenetischem Protein 2 (BMP2) wurden nicht nachgewiesen. Ebenso waren die AECs positiv für CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC und negativ für CD14, CD34, CD45, CD49d und HLA-DR, wie durch FACS-Analysen bestimmt. Weitere Untersuchungen zeigten, dass AECs Stammzellmarker wie SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, geschlechtsbestimmende Region Y-Box 2 (Sox2), Tra1-60 und Tra1-80, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 4 (FGF4), Rex-1, kryptisches Protein (CFC-1) und Prominin 1 (PROM-1) exprimieren.

3. Transcriptomics

3.1. Amnionflüssigkeits-Stammzellen

Eine funktionelle Analyse der Genexpressionssignatur von AF-MSCs im Vergleich zu Knochenmark- (BM-), Nabelschnurblut- (CB-) und AM-MSCs wurde ursprünglich von Tsai et al. durchgeführt. Gene, die in MSZ aus allen drei Quellen exprimiert wurden, konnten in Gruppen eingeteilt werden, die mit (i) dem Umbau der extrazellulären Matrix (CD44, Kollagen II (COL2), insulinähnlicher Wachstumsfaktor 2 (IGF2), und Gewebsinhibitor der Metalloproteinase 1 (TIMP1)), (ii) Zytoskelettregulierung (Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (PLAU) und Rezeptor (PLAUR)), (iii) Chemokinregulierung und Adhäsion (Alpha-Actinin 1 (ACTN1), actin-related protein complex subunit 1B (ARPC1B) und Thrombospondin 1 (THBS1)), (iv) Plasminaktivierung (tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2)), (v) Transforming Growth Factor β (TGFβ)-Rezeptor-Signalisierung (Caveolin 1 (Cav1), Caveolin 2 (Cav2), Cyclin-abhängiger Kinase-Inhibitor 1A (CDKN1A)) und (vi) Gene, die für E3-Ubiquitin-Ligasen (SMURF) codieren. Zu den hochregulierten Genen in AF-MSCs im Vergleich zu BM-, CB- und AM-MSCs gehörten Moleküle, die an der Uterusreifung und -kontraktion beteiligt sind, wie der Oxytocinrezeptor (OXTR) und die Regulierung der Prostaglandinsynthese, wie die Phospholipase A2 (PLA2G10). Andere hochregulierte Gene in dieser Gruppe waren an der Signaltransduktion beteiligt, die mit (i) der durch Thrombin ausgelösten Reaktion ((F2R und F2RL)), (ii) der Hedgehog-Signalgebung ((Hedgehog-Acyltransferase (HHAT)) und (iii) G-Protein-verwandten Signalwegen (rho-verwandtes GTP-bindendes Protein (RHOF), Regulator der G-Protein-Signalgebung 5 und 7 (RGS5, RGS7) und Phospholipase C beta 4 (PLCB4)) zusammenhängen.

In neueren Studien über AFSCs beschrieben Kim et al. zum ersten Mal die Veränderungen der Genexpression in der gesamten AFSC-Population während verschiedener Passagen durch Illumina-Mikroarray-Analyse. Es wurden 1970 unterschiedlich exprimierte Gene entdeckt und entsprechend ihrer Expressionsprofile in 9 verschiedene Cluster eingeteilt. Zu den Genen mit allmählich ansteigender Expression gehörten Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 12 (CXCL12), Cadherin 6 (CDH6) und Folatrezeptor 3 (FOLR3). Zu den herunterregulierten Genen gehörten unter anderem Cyclin D2 (CCND2), Keratin 8 (K8), IGF2, natriuretischer Peptidvorläufer (BNP) B und zelluläres Retinsäurebindungsprotein 2 (CRABPII). Um weitere Informationen zu erhalten, wurde eine Analyse der Chipdaten zu alternden Genen durchgeführt, die eine Hochregulierung von Gentranskripten wie Nervenwachstumsfaktor beta (NGFβ), Insulinrezeptorsubstrat 2 (IRS-2), insulinähnliches Wachstumsfaktorbindungsprotein 3 (IGFBP-3) und Apolipoprotein E (APOE) ergab. Expression von Genen wie PLAU, E2F-Transkriptionsfaktor 1 (E2F1), IGF2, Brustkrebs-Typ-1-Suszeptibilitätsgen (BRCA1), DNA-Topoisomerase 2-alpha (TOP2A), proliferierendes Zellkernantigen (PCNA), Forkhead Box M1 (FOXM1), Cyclin-A2-Gen (CCNA2), budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (BUB1B), und cyclin dependent kinase 1 (CDC2), wurde während der Kultur allmählich herunterreguliert .

Wolfrum et al. führten eine globale Genexpressionsanalyse von AFSCs im Vergleich zu iPSCs aus AF (AFiPSC) und ESCs durch. Darunter befanden sich Gene, die mit Selbsterneuerung und Pluripotenz (1299 Gene, z.B. POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, microRNA-binding protein LIN28) und AFSCs-Spezifität (665 Gene, z.B., OXTR, HHAT, RGS5, Neurofibromatose Typ 2 (NF2), Protectin (CD59), Tumor-Nekrose-Faktor-Superfamilienmitglied 10 (TNFSF10), 5′-Nukleotidase (NT5E)) wurden in AFSCs nachgewiesen. Darüber hinaus untersuchten die Autoren die Expression von Seneszenz- und Telomer-assoziierten Genen in AFSCs früher und späterer Passage, um die Wirkung der Reprogrammierung auf die Umgehung der in AFSC-Kulturen beobachteten Seneszenz zu untersuchen. Es wurden vierundsechzig Gene identifiziert, die in AFSCs im Vergleich zu AFiPSC-Linien unterschiedlich exprimiert werden. Darunter befanden sich Telomer-assoziierte Gene und Gene, die an der Regulierung des Zellzyklus beteiligt sind, wie z. B. Mitotic arrest deficient-like 2 (MAD2L2), die Poly-ADP-Ribose-Polymerase 1 (PARP1), das Replikationsprotein A3 (RPA3), Dyskeratosis congenita 1 (DKC1), das mutS-Homolog 6 (MSH6), das CHK1-Checkpoint-Homolog (CHEK1), die Polo-like Kinase 1 (PLK1), die POU-Klasse-2-Homeobox 1 (POU2F1), CDC2, das Bloom-Syndrom-Gen RecQ helicase-like (BLM), das Werner-Syndrom-Gen RecQ helicase-like (WRN), die DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1), die DNA-Methyltransferase 3 beta (DNMT3B), Lamin B1 (LMNB1) und der DNA-Replikationsfaktor 1 (CDT1) wurden in AFSCs im Vergleich zu AFiPSCs und ESCs herunterreguliert. Im Gegensatz dazu waren Peptidylprolyl cis/trans-Isomerase (PIN1), Lamin A/C (LMNA), Wachstumsstopp und DNA-Schaden induzierbares Alpha (GADD45A), Chromobox homolog 6 (CBX6), NADPH-Oxidase 4 (NOX4), Endoglin (ENG), Histon H2B Typ 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15 (GDF15) und Serinprotease-Inhibitor 1 (SERPINE1), unter anderem, wurden in AFSCs im Vergleich zu AFiPSCs und ESCs hochreguliert.

3.2. Amnionmembran-Stammzellen

Eine transkriptomische Analyse unter Verwendung von DNA-Mikroarrays wurde für AM-MSCs berichtet. Diese experimentellen Daten lieferten Informationen über das Genexpressionsmuster von AM-MSCs im Vergleich zu Genexpressionsprofilen von AF-, CB- und BM-MSCs. Es wurden mehrere hochregulierte Gene in AM-MSCs identifiziert, die an der Regulierung der Immunadaptation an der maternoplazentaren Schnittstelle beteiligt sind. Unter anderem wurden Spondin 2 (SPON2), Interferon alpha induzierbares Protein 27 (IFI27), Bradykininrezeptor B1 (BDKRB1), kleine induzierbare Zytokine der Subfamilie B Mitglied 5 und 6 (SCYB5, SCYB6) und Yamaguchi sarcoma viral-related oncogene homolog (LYN) hochreguliert. Zu den weiteren Genen mit erhöhter Expression in AM-MSCs im Vergleich zu AF-, CB- und BM-MSCs gehörten (i) Transkriptionsfaktoren wie Forkhead Box F1 (FOXF1), Heart and Neural Crest Derivatives Expressed 2 (HAND2) und Transkriptionsfaktor 21 (TCF21) und (ii) Stoffwechselenzyme wie Dipeptidyl-Peptidase 6 (DPP6), Tryptophan-2,3-Dioxygenase (TDO2) und Sialyltransferasen (STs) .

4. Proteomics

4.1. Amniotic Fluid Stem Cells

Proteomische Untersuchungen an der gesamten AFSC-Population, einschließlich epithelioider (E-Typ), amniotic fluid specific (AF-Typ) und fibroblastic (F-Typ) Zellen, ergaben 2400 Spots, die zur Identifizierung von 432 verschiedenen Genprodukten führten. Die Mehrheit der Proteine war im Zytoplasma (33 %), in den Mitochondrien (16 %) und im Zellkern (15 %) lokalisiert und stellte hauptsächlich Enzyme (174 Proteine) und Strukturproteine (75 Proteine) dar. Ein relativ hoher Prozentsatz von Membran- und membranassoziierten Proteinen war ebenfalls vorhanden (7 %). Unter den entdeckten Proteinen waren 9, die Epithelzellen entsprechen, wie ATP-Synthase D-Kette (ATP5H), NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase 30 kDa Untereinheit (NUIM), Annexin II (Anx2), Annexin IV (Anx4), 40S ribosomales Protein SA (Rpsa), Glutathion S-Transferase P (GSTP), Hauptgewölbeprotein und Cytokeratine 19 und 7 (CK-19, CK-7), während 12 Proteine in Fibroblasten exprimiert werden, darunter Fibronektine, Tropomyosine, Transgelin (TAGLN), Arp2/3-Komplex 34 kDa Untereinheit (P34-arp), Gelsolin (Gsn), Elongationsfaktor 1-β (EF-1β) und andere. Acht Proteine wurden in Keratinozyten exprimiert, darunter Keratine, Ribonukleoproteine, Anx2, Aetyl-CoA-Acetyl-Transferase (ACAT1) und andere, drei in der Epidermis, darunter Tropomyosine und Keratine und eines im mesenchymalen Zelltyp (Vimentin 1 (Vim 1)) .

Rezente Studien haben gezeigt, dass eine Vielfalt von Stoffwechselenzym-Expressionen in den Amnionzellen an metabolischen und genetischen Syndromen beteiligt ist, und daher könnte deren Nachweis für die pränatale Diagnose wichtig sein. Eine detailliertere Analyse zur Bestimmung spezifischer Stoffwechselenzyme in AFSCs wurde von Oh et al. durchgeführt. Neunundneunzig Proteine wurden identifiziert, darunter kohlenhydratverarbeitende Enzyme, aminosäureverarbeitende Enzyme, Proteine des Purinstoffwechsels und Enzyme des intermediären Stoffwechsels.

Eine Proteomanalyse wurde auch an verschiedenen Kulturpassagen von CD117+ AFSCs durchgeführt und zeigte Variationen in der Proteinexpression, die hauptsächlich in frühen Passagen auftraten. Dreiundzwanzig Proteine wurden zwischen frühen und späten Passagen unterschiedlich exprimiert, wobei die am stärksten herunterregulierten Proteine Col1, Col2, Vinculin (Vcl), CRABP II, Stathmin (STMN1) und Cofilin-1 (CFL1) waren. Im Gegensatz dazu sind TAGLN und Col3 während der Passagen erhöht. Proteine, die während der Passagen dysregulierte Spiegel aufwiesen, waren die 26S-Protease-Regulator-Untereinheit 7 (PSMD7), das Ubiquitin-Carboxylterminal-Hydrolase-Isoenzym L1 (UCH-L1), das heterogene nukleare ribonukleare Protein H (hnRNP H) und das TAR-DNA-bindende Protein 43 (TDP-43) .

Im Jahr 2007 wurde die Proteomkarte von menschlichen AF-MSCs erstellt und direkt mit der von BM-MSCs verglichen. 261 verschiedene Proteine wurden in AF-MSCs identifiziert, wobei die meisten Proteine im Zytoplasma (41 %) lokalisiert waren, während andere im endoplasmatischen Retikulum (8 %), im Zellkern (13 %), in den Mitochondrien (12 %), in den Ribosomen (1 %), im Zytoskelett (6 %), im Zytoplasma und im Zellkern (5 %) sowie in sekretierten Proteinen (2 %) gefunden wurden. AF-MSCs exprimierten eine Reihe von Proteinen, die mit der Proliferation und der Zellerhaltung zusammenhängen, wie Ubiquilin-1 (UBQLN1), von dem bekannt ist, dass es die Progression des Zellzyklus und das Zellwachstum steuert, das proliferationsassoziierte Protein 2G4 (PA2G4), ein Protein, das das Wachstum im Zellkern reguliert, das sekretierte Protein acidic and rich in cysteine (SPARC), das während der Embryogenese reguliert wird und an der Kontrolle des Zellzyklus und der Zelladhäsion beteiligt ist, und das Enhancer of Rudimentary Homolog (ERH), das ebenfalls den Zellzyklus reguliert. TAGLN und Galectin 1 (Gal 1), die beide in Stammzellen vorkommen und mit der Differenzierung zusammenhängen, wurden in AF-MSCs ebenfalls reichlich exprimiert. Andere Proteine, die in AF-MSCs in hohem Maße exprimiert wurden, standen im Zusammenhang mit (i) der Entwicklung, wie z. B. Deltex-3-like (DTX3L), und (ii) der Organisation und Bewegung des Zytoskeletts, wie z. B. CFL1, das Coactosin-ähnliche Protein (CLP) und das Enable-Protein-Homolog (Enah). Wie erwartet, wurde Vim auch in AF-MSCs in hohen Mengen exprimiert. In dieser Studie wurde auch ein detaillierter Vergleich der gemeinsamen identifizierten Proteine in AF-Zellen und AF-MSCs beschrieben.

In unserer späteren Studie erstellten wir die proteomische Karte der beiden morphologisch unterschiedlichen mesenchymalen Vorläuferzelltypen (SS und RS) von AF durch 2-DE. Fünfundzwanzig Proteine wurden in den beiden Subpopulationen unterschiedlich exprimiert. Zu den Proteinen, die in SS-AF-MSCs im Vergleich zu RS-AF-MSCs vermehrt exprimiert wurden, gehörten Reticulocalbin-3-Vorläufer (RCN3), Kollagen α1 (I) (COL1α1), FK506-bindendes Protein 9-Vorläufer (FKBP9), Rho GDP-Dissoziationsinhibitor 1 (RhoGDI), intrazelluläres Chloridkanalprotein 4 (CLIC4), Tryptophanyl-tRNA-Synthetase (TrpRS) und 70 kD Hitzeschockprotein (HSP70). Peroxiredoxin 2 (Prdx2), 60 kD Hitzeschockprotein (HSP60), GSTP und Anx4 wurden in RS-AFMPCs hochreguliert. Zu den Proteinen, die in RS-AF-MSCs identifiziert wurden, gehörten jedoch nur Cytokeratin-8, -18 und -19 (CK-8, -18 und CK-19), Cathepsin B (CTSB), CLP und Integrin αV-Protein (CD51). Mesenchym-verwandte Proteine wie Vim, Gal, Gsn und Prohibitin (PHB) wurden in beiden Populationen in gleichem Maße exprimiert.

4.2. Amnionmembran-Stammzellen

Ein detaillierter Ansatz zur Untersuchung menschlicher AM-Proteine wurde von Hopkinson et al. beschrieben. In dieser Studie führten die Autoren eine proteomische Analyse von AM-Proben durch, die für die Transplantation beim Menschen vorbereitet worden waren, indem sie 2-DE-Gele verwendeten. Die Waschmedien der AM-Proben wurden ebenfalls untersucht und die sezernierten Proteine identifiziert. Die sowohl in der AM als auch in den Waschmedien nachgewiesenen Proteine deuten darauf hin, dass eine teilweise Proteinfreisetzung stattgefunden hat. Bei diesen Proteinen handelte es sich zumeist um lösliche zytoplasmatische Proteine, die entsprechend ihrer subzellulären Lokalisierung und Funktion kategorisiert wurden. Ein Beispiel für die häufigsten und konsistentesten Proteine in AM ist THBS1, das Berichten zufolge eine Rolle bei der Wundheilung, Entzündungsreaktion und Angiogenese spielt. Mimecan (auch Osteoglycin/OGN genannt) ist ein weiteres in AM nachgewiesenes Protein, das ein kleines leucinreiches Proteoglykan darstellt, das in der ECM des Bindegewebes zu finden ist. Es wird berichtet, dass Mimecan die Zugfestigkeit und Hydratation des Gewebes aufrechterhält. Darüber hinaus wurde die größere Form von Mimecan in AM-Zellen exprimiert und war anfällig für proteolytische Spaltung . Das TGF-β-induzierte Protein ig-h3 (βIG-H3), ein ECM-Adhäsivmolekül, das während der Zelldifferenzierung und Wundheilung als membranassoziierter Wachstumsfaktor fungiert, und Intergrin α6 (CD49f), eine Komponente des α6β4-Integrins, waren ebenfalls in signifikanten Mengen in AM-Zellen vorhanden. Es ist bekannt, dass die α6β4-βIG-H3-Interaktion eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von Zelladhäsions- und Wundheilungssignalwegen spielt.

Eine weitere wichtige Studie von Baharvand et al. konzentrierte sich auf die Analyse von epithelial entnommener menschlicher AM und zeigte sowohl quantitative als auch qualitative Unterschiede im Vergleich zu unbehandelter AM. Sie untersuchten das Proteom des menschlichen AM-Epithels, das als limbale Stammzellnische für die Behandlung der Rekonstruktion der Augenoberfläche verwendet wurde. In allen 2-DE-Gelen wurden 515 Spots entdeckt, und 43 Proteine wurden mittels MALDI TOF/TOF MS in AM identifiziert. Die am häufigsten vorkommenden Proteine waren verschiedene Isoformen von Lumican (LUM) und OGN, beides Mitglieder der Proteoglykan (PG)-Familie. Insbesondere OGN könnte bei vielen biologischen Prozessen wie Zellwachstum, Angiogenese und Entzündungen eine Rolle spielen. Weitere nachgewiesene Proteine waren Kollagen VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), die Beta-Kette von Fibrinogen (FGB), die Transglutaminase 2 Isoform A (TGM2A), die b-Actin-Variante (ACTB), das 70 kD Hitzeschockprotein 5 (HSPA5), Nidogen 2 (NID2), CD49f, βIG-H3 und Tubulointerstitielle Nephritis (TIN) . Einige der in dieser Studie identifizierten Proteine standen auch mit der extrazellulären Matrix (ECM) in Verbindung. Von den entdeckten Proteinen wurde berichtet, dass Fibronektin (FN), Laminine und Kollagen IV (Col4) und VII die epitheliale Adhäsion und Migration fördern.

5. Sekretom

In jüngster Zeit wurden bedeutende Fortschritte bei der Analyse der sekretierten Proteine von AFSC erzielt. Es wurde dokumentiert, dass das AFSC-Sekretom für die Förderung der Gefäßbildung verantwortlich ist und eine starke angiogene Reaktion bei Mäusen hervorrufen kann. Laut dieser Studie ergab eine detaillierte Analyse des AFSC-konditionierten Mediums mit Hilfe der MAP-Technologie von Luminex das Vorhandensein bekannter proangiogener und antiangiogener Faktoren. Als sezernierte Proteine wurden der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF), der von Stromazellen stammende Faktor 1 (SDF-1), Interleukin 8 (IL-8), das monozytenchemotaktische Protein 1 (MCP-1) und zwei Angiogenese-Hemmer, Interferon-gamma (IFNγ) und Interferon-gamma-induziertes Protein 10 (IP-10), identifiziert. Es wurde auch gezeigt, dass eine relativ geringe Anzahl von AFSC ausreicht, um eine nachweisbare Menge an proangiogenen Wachstumsfaktoren und Zytokinen zu sezernieren. Die Sekretion dieser Faktoren kann dosisabhängig in Abhängigkeit von der Ausgangszellzahl der verwendeten Zellen reguliert werden.

Eine systematische Studie über die von AFSC sezernierten Proteine führte zu der Schlussfolgerung, dass proangiogene lösliche Faktoren aus AFSC die Rekrutierung von endothelialen Vorläuferzellen in einem ischämischen Rattenmodell vermitteln können. Insbesondere konnte konditioniertes Medium aus AFSCs topisch angiogene Wachstumsfaktoren und Zytokine in den Hautlappen des ischämischen Rattenmodells einbringen und war für die Auslösung der endogenen Reparatur durch die Rekrutierung endothelialer Vorläuferzellen verantwortlich.

In unseren jüngsten Studien untersuchten wir das therapeutische Potenzial von AF-MSCs und ihren sezernierten Molekülen bei Mäusen mit akutem Leberversagen. Eine Vielzahl von Zytokinen und Wachstumsfaktoren wurde im konditionierten Medium von AF-MSCs nachgewiesen. Es wurden Zytokine wie Interleukin 10 (IL-10), Interleukin 27 (IL-27), die Interleukin-17-Familie (IL-17E), Interleukin 12p70 (IL-12p70), Interleukin-1 beta (IL-1β) und Interleukin-1-Rezeptorantagonist (IL-1ra) nachgewiesen, die für die lokale und systemische Herabregulierung pro-inflammatorischer Mediatoren verantwortlich sind. SERPINE1, MCP-1 und SDF-1, die für die Förderung der Gewebereparatur verantwortlich sind, wurden ebenfalls sezerniert. Interessanterweise gehörten zu den hoch exprimierten Wachstumsfaktoren der aus Blutplättchen gewonnene Endothelzell-Wachstumsfaktor (PD-ECGF), Endostatin/Kollagen XVII (EN/Col17), Urinplasminogenaktivator (uPA), TIMP1, TIMP2, heparinbindender EGF-ähnlicher Wachstumsfaktor (HB-EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor 7 (FGF7) und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), die für die Leberregeneration und die Gewebereparatur verantwortlich sind .

6. Zusammenfassung

Die bisherigen Daten deuten darauf hin, dass Fruchtwasser und Amnionmembran vielversprechende Quellen für Stammzellen mesenchymalen Ursprungs darstellen können. Tatsächlich sind MSZ in größerer Menge vorhanden, und es wurde eine Vielzahl von Protokollen für ihre Isolierung beschrieben. Es wird jedoch berichtet, dass unterschiedliche Kulturbedingungen desselben Zelltyps ihr unterschiedliches Genexpressionsmuster beeinflussen können, was eine Einschränkung für ihre Isolierung und Expansion in vitro darstellt. Studien, die phänotypische Analysen mit Methoden wie Durchflusszytometrie und Immunhistochemie sowie Transkriptomik-, Proteomik- und Sekretomanalysen umfassen, zielen auf die Bestimmung des Proteinprofils dieser Zellen ab (Abbildung 1). Es wird erwartet, dass die durch solche Studien gewonnenen Daten ihr differenzielles Repertoire klären und das molekulare Profil dieser Stammzellen validieren werden. Das Hauptproblem, das dringend angegangen werden muss, ist jedoch die Isolierung einer homogenen Population, die systematische Studien zur Aufklärung der Funktion dieser multipotenten Zellen erleichtern kann.

Abbildung 1

Zusammenfassung der wichtigsten Marker, die in AFCs und AMCs mit Hilfe von Transkriptomik-, Proteomik-, Sekretom- und Immunphänotyp-Analysen ermittelt wurden. Proteine, die in mehr als einer Studie identifiziert wurden, sind fett markiert.

Solche Ansätze können zur Identifizierung von Schlüsselantigenen führen, die den Phänotyp dieser Zellen widerspiegeln und ihre besonderen Eigenschaften erklären. Diese Art von Studien wird den Weg für eine systematische und effiziente Isolierung dieser Zellen vor ihrer Verwendung in der Klinik ebnen.

Anhang

Fragen für weitere Untersuchungen

Welches sind die geeigneten Isolierungsmethoden und Kulturbedingungen für AFSCs oder AMSCs, die die Identifizierung eines einheitlichen Phänotyps ermöglichen?

Gibt es einen einzigen Marker, der für die Isolierung von AFSCs oder AMSCs verwendet werden kann?

Die AFSC- und AMSC-Populationen sind heterogen und unterscheiden sich in ihren phänotypischen und molekularen Eigenschaften. Methoden zur Isolierung können zu einer homogenen Zellpopulation führen.

AFSCs oder AMSCs können als Werkzeuge in der regenerativen Medizin verwendet werden: Schaffung von Kulturbedingungen mit minimalen oder keinen tierischen Substanzen.

Marker Discovery
Die anfängliche Charakterisierung von AFSCs und AMSCs kann durch Immunphänotyp-Analyse unter Verwendung gut charakterisierter Zelloberflächenmarker wie AFSCs: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSCs: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1 und PROM1.

Transkriptomik und Proteomik enthüllten die Identifizierung von Schlüsselmarkern wie
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1, und Gal; AMSCs: OGN, βIG-H3 und CD49F.
Da es keinen gemeinsamen Marker für AFSC und AMSC gibt, muss eine breitere Palette von Markern verwendet werden. Dies legt auch die Durchführung weiterer detaillierter Array- und Funktionsanalysen nahe, um die am besten geeigneten Marker für die Charakterisierung von AFSC und AMSC zu definieren.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.