Nach seinem Abschluss an der Southwest Texas State University in San Marcos, Texas, schloss sich Boothe dem Repertoire-Ensemble des Oregon Shakespeare Festivals an, wo er unter anderem Rollen in Heinrich IV, Teil 2 (in der Rolle des Heinrich IV. von England) und Troilus und Cressida übernahm. Sein New Yorker Bühnendebüt gab er 1974 in der Lincoln-Center-Produktion von Richard III. Fünf Jahre später gab er sein Broadway-Theaterdebüt in einer Hauptrolle in dem Einakter Lone Star, geschrieben von James McLure.
Boothe erlangte 1980 zum ersten Mal nationale Aufmerksamkeit, als er Jim Jones in dem CBS-Fernsehfilm Guyana Tragedy: The Story of Jim Jones. Boothes Darstellung des verrückten Sektenführers wurde von der Kritik gelobt. In einem Bericht der Time über die Produktion wurde Boothe gelobt: „Es gibt eine außergewöhnliche Leistung. Ein junger Schauspieler namens Powers Boothe fängt das ganze Charisma und das Böse von ‚Dad‘, Jim Jones, ein.“ Boothe gewann den Emmy Award für seine Rolle und setzte sich damit gegen die Veteranen Henry Fonda und Jason Robards durch. Als die Schauspielergewerkschaft Screen Actors Guild im Herbst 1980 streikte, war er der einzige Schauspieler, der die Streikposten überschritt, um an der Zeremonie teilzunehmen. Er sagte damals: „Das ist entweder der mutigste Moment meiner Karriere oder der dümmste.“
Boothe verkörperte Philip Marlowe in einer Fernsehserie, die auf den Kurzgeschichten von Raymond Chandler basiert und in den 1980er Jahren für HBO lief. Er spielte in Filmen wie Southern Comfort, A Breed Apart, Red Dawn, The Emerald Forest, Rapid Fire und Extreme Prejudice sowie in den HBO-Filmen Into the Homeland und By Dawn’s Early Light. Außerdem wirkte er 1990 in dem CBS-Fernsehfilm Family of Spies mit, in dem er den verräterischen Navy-Offizier John Walker spielte. Boothe spielte Curly Bill Brocius in dem erfolgreichen Western Tombstone (1993), den illoyalen ranghohen Armeeoffizier in Blue Sky (im Gegensatz zu Jessica Langes Oscar-gekrönter Darstellung) und den finsteren Hauptterroristen in Sudden Death. Außerdem gehörte er zum großen Ensemble von Oliver Stones Nixon (als Stabschef Alexander Haig) und U Turn (als Stadtsheriff).
Im Jahr 2001 spielte er die Hauptrolle des Flavius Aëtius, des römischen Generals, der die Invasion der Hunnen in der TV-Miniserie Attila aufhalten soll. Boothe spielte eine Hauptrolle als Bordellbesitzer Cy Tolliver in der HBO-Serie Deadwood und den zwielichtigen Senator Roark in dem Kinofilm Sin City (2005) sowie in dessen Fortsetzung Sin City: A Dame to Kill For (2014). Er ist die Stimme einer der Figuren im Videospiel Area 51 (2005) und von Gorilla Grodd, dem hyperintelligenten, telepathischen Superschurken in Justice League und Justice League Unlimited. Er sprach den Bösewicht Kane im Videospiel Turok aus dem Jahr 2008.
Er war ein besonderer Gaststar in 24, wo er den Vizepräsidenten Noah Daniels spielte. Er kehrte im Prequel zur siebten Staffel, 24: Redemption, zurück. Kurz nachdem er die Rolle des amtierenden Präsidenten übernommen hat, sieht man Boothe beim Verlassen der Air Force Two mit F-15s im Hintergrund. Boothe spielte in Red Dawn einen abgeschossenen F-15-Piloten. Im März 2008 sprach er einen Fernsehwerbespot für die Präsidentschaftskampagne von Senator John McCain.
Im Jahr 2012 erschien Boothe in Joss Whedons The Avengers in einer geheimnisvollen Rolle als schattenhafter Regierungsvorgesetzter von S.H.I.E.L.D. 2015-16 wiederholte er die Rolle, jetzt unter dem Namen Gideon Malick, in ABCs Agents of S.H.I.E.L.D.
Boothe erschien 2012 in der Miniserie Hatfields & McCoys als Richter Valentine „Wall“ Hatfield. Boothe wurde auch als Lamar Wyatt in der ABC-Musikdramaserie Nashville besetzt. Boothe lieh auch seine Stimme für Hitman: Absolution, ein 2012 von IO Interactive entwickeltes Videospiel, in dem er die Figur des Benjamin Travis verkörperte.