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Streptokokken sind die häufigsten Bewohner des menschlichen Mundes (6, 24), und sie gelangen häufig über parodontale Läsionen oder orale Abschürfungen, die durch Routinetätigkeiten entstehen, in die Blutbahn (32). Dies kann zu schwerwiegenden Erkrankungen führen, darunter infektiöse Endokarditis (IE) (28) und neutropenische Bakteriämie (29). Die Taxonomie der oralen Streptokokken war lange Zeit eine Quelle der Verwirrung (4, 9, 20, 22, 31). Die Sequenzierung des 16S rRNA-Gens hat zu einer erheblichen Klärung der Situation geführt (13); allerdings fehlt es diesem Ansatz an der erforderlichen Sensibilität, um bestimmte eng verwandte Arten wie Streptococcus mitis und Streptococcus oralis (12) zu unterscheiden oder um eine Stammtypisierung oder phylogenetische Analyse innerhalb der Arten zu ermöglichen. Daher wurden Gene mit größerer Variabilität untersucht, darunter der intergene transkribierte Spacer (ITS) der 16S-23S rRNA (2), proteinkodierende Housekeeping-Gene (1, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 23) oder beide (17, 18). Ein Konsens über das oder die für diese Zwecke am besten geeigneten Gene steht noch aus. Darüber hinaus haben frühere Studien zwar orale Streptokokken aus klinischen Blutkulturen mit definitiven Sequenzierungsmethoden identifiziert (12, 23, 30), aber keine hat detaillierte klinische Informationen über die zugrunde liegende Krankheit geliefert. Wir haben uns vorgenommen, beides zu tun.

Blutkulturen, die von Mai 2003 bis Mai 2008 am Virginia Commonwealth University Medical Center Hospital durchgeführt wurden, wurden vom klinischen Mikrobiologielabor als vermutlich streptokokkenhaltig identifiziert. Ein Computerskript wurde verwendet, um nicht-orale Arten auszuschließen. Um die Analyse von Verunreinigungen zu vermeiden, wurden Isolierplatten nur angefordert, wenn zwei oder mehr Berichte von getrennten Kulturen desselben Patienten stammten. Von jeder verfügbaren Isolierplatte wurde eine Kolonie in einer Brühkultur angezüchtet und makroskopisch und mikroskopisch untersucht. Wurden bei getrennten Kulturen desselben Patienten Unterschiede festgestellt, wurden beide Kulturen beibehalten. Andernfalls wurde von jedem Patienten eine einzige Kultur kryokonserviert und Aliquots für die PCR-Amplifikation entnommen.

Um die Artidentität und die phylogenetische Verwandtschaft der einzelnen Isolate zu bestimmen, wurde die 16S-23S ITS mit den zuvor beschriebenen Primern 6R und 13BF amplifiziert (2). Als von einigen Isolaten keine Produkte erhalten wurden, stellten wir fest, dass die letzten drei Nukleotide des 6R-Primers nicht mit 23S-rRNA-Sequenzen in GenBank von mehreren interessanten Arten übereinstimmten. Daher verkürzten und vereinfachten wir den 6R-Primer und schufen 6R-S. Außerdem verkürzten wir den 13BF-Primer, um seine Annealing-Temperatur anzupassen (siehe Tabelle S1 im ergänzenden Material). Über eine ähnliche Modifikation des 6R-Primers wurde kürzlich berichtet (18). Unter Verwendung dieser Primer wurden PCR-Amplikons von allen Isolaten gewonnen und zur Kapillar-DNA-Sequenzanalyse eingereicht.

Die meisten DNA-Sequenzen enthielten die vollständige ITS und Teile der 16S- und 23S-rRNA-Gene, die mit ITS-Sequenzen von Typ-Stämmen, die in GenBank verfügbar sind, abgeglichen wurden oder von uns anhand von Stämmen aus der American Type Culture Collection (ATCC) bestimmt wurden. Wir stellten fest, dass flankierende 16S- und 23S-Sequenzen, die in den meisten veröffentlichten Sequenzen nicht enthalten sind, den ITS-Abgleich erleichtern. Tatsächlich wurden mindestens vier Sequenzen von Typstämmen veröffentlicht (18), in denen ein CTAAGG, das sich 78 bp vor dem 3′-Ende des 16S rRNA-Gens befindet, offenbar mit einer identischen Hexanukleotidsequenz verwechselt wurde, die zuvor (2) als Beginn der ITS definiert wurde. Gekürzte ITS-Sequenzen (2) wurden dann verglichen und mit der Software MEGA 4 (25) ausgerichtet, um einen phylogenetischen Baum zu erstellen (Abb. 1).

Es wurde bereits früher vorgeschlagen, dass die ITS-Analyse allein für die Speziesidentifikation von oralen Streptokokken, einschließlich der eng verwandten Spezies S. mitis und S. oralis, ausreichend ist. Es wurde angenommen, dass konservierte Ein-Basen-Deletionen an zwei Stellen und eine ITS-Gesamtlänge von 246 bp für S. oralis charakteristisch sind, während S. mitis keine Deletionen aufweist und eine ITS von 248 bis 249 bp besitzt (2, 3). In unserer Studie fanden wir Isolate beider Arten, die beide Deletionen oder keine Deletionen aufwiesen und deren ITS-Längen sich überlappten. Somit konnten die Isolate von S. oralis und S. mitis anhand dieser Kriterien nicht zuverlässig unterschieden werden. In einer anderen Studie wurde festgestellt, dass die ITS-Sequenzanalyse zwar nicht zur Unterscheidung von S. oralis und S. mitis ausreicht, wohl aber zur Identifizierung vieler anderer oraler Streptokokkenarten, einschließlich solcher, die zur Anginosus-Gruppe gehören (18). Wir fanden jedoch ein Isolat der zur Anginosus-Gruppe gehörenden Spezies S. intermedius (VMC38), das nicht durch ITS klassifiziert werden konnte (siehe Tabelle S1 im ergänzenden Material).

Eine große Anzahl von Isolaten, insbesondere für S. mitis und Streptococcus constellatus, besaß ebenfalls identische Sequenzen, was eine phylogenetische Analyse ausschloss. Identische Sequenzen wurden auch von fünf Isolatpaaren erhalten, die von denselben Patienten stammten (Daten nicht gezeigt).

Da die ITS-Analyse für unsere Zwecke nicht ausreichte, sequenzierten wir ein zweites gemeinsames Ziel – das sodA-Gen, das für die manganabhängige Superoxiddismutase kodiert (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Dies ermöglichte den Ausschluss mehrerer Isolate. Die oben erwähnten Stammpaare, die von denselben Probanden stammen und identische ITS-Sequenzen aufweisen, besaßen auch identische SodA-Sequenzen, was bestätigte, dass die Isolate identisch waren, und ein Isolat aus jedem Paar wurde ausgeschlossen. Zwei Isolate wurden aufgrund eines offensichtlichen Fehlers bei der Handhabung der Stämme verworfen, und ein weiteres wurde nicht beibehalten, da die ITS- und sodA-Sequenzen darauf hinwiesen, dass es sich um einen Stamm von Enterococcus faecalis handelte. Ein aus den verbleibenden Isolaten abgeleiteter phylogenetischer Baum ist in Abb. 1 dargestellt.

Das sodA-Alignment war dem der ITS für die phylogenetische Analyse überlegen. Die einzigen Isolate mit identischen sodA-Sequenzen waren zwei S. mitis-Stämme und zwei Stämme von Streptococcus vestibularis. Das sodA-Alignment war auch für die Artbestimmung nützlicher. Alle Referenzstämme waren im phylogenetischen Baum gut voneinander getrennt. Das Ergebnis waren nur vier mehrdeutige Spezieszuordnungen für sodA, verglichen mit 15 für die ITS (siehe Tabelle S1 im ergänzenden Material). In den Fällen, in denen eine einzige Artbezeichnung sowohl mit den ITS- als auch den sodA-Sequenzen übereinstimmte, wurde diese Bezeichnung verwendet. Nur 3 der 58 klinischen Isolate konnten mit dieser Methode nicht sicher identifiziert werden. Die Isolate VMC1 und VMC43 lieferten ITS-Sequenzen, die trotz wiederholter Sequenzierungsversuche zu kurz waren, um aussagekräftig zu sein, und VMC58 wurde durch ITS- und sodA-Sequenzen nicht eindeutig identifiziert (Abb. 1; Tabelle S1). Wir bestätigten die Speziesidentität dieser Isolate mit Hilfe einer kürzlich veröffentlichten Datenbank, die Sequenzen von sieben Housekeeping-Genen aus 420 gut charakterisierten Streptokokkenstämmen enthält, darunter sodA, pfl und pyk (1). Die Sequenzen der pfl- und/oder pyk-Gene aller fraglichen Stämme wurden bestimmt und mit den Sequenzen in der eMLSA.net-Datenbank (http://www.emlsa.net/) abgeglichen, ebenso wie die vorhandenen sodA-Sequenzen. In allen Fällen stimmten die Zuordnungen der pfl- und pyk-Arten mit denen von sodA überein. Darüber hinaus zeigte das sodA-Alignment, dass die VMC58-Sequenz, obwohl sie vom Typstamm abweicht, zu einem Cluster von 13 Streptococcus infantis-Isolaten in der Datenbank gehört (Daten nicht gezeigt). Die Konsensus-Spezies-Identifizierung aller in die Studie einbezogenen Isolate ist in Abb. 1 und in den Tabellen S1 und S2 im Zusatzmaterial angegeben.

Während diese Ergebnisse darauf hindeuten, dass die SodA-Analyse allein zur Identifizierung der meisten Stämme ausreicht, empfehlen wir die Einbeziehung mindestens eines zusätzlichen proteincodierenden Housekeeping-Gens für alle Stämme. Viele orale Streptokokken sind von Natur aus kompetent, und es wurde von Fällen berichtet, in denen fremde Housekeeping-Gene, einschließlich sodA, erworben wurden (1, 12). In unserer Studie war dies nicht offensichtlich, aber es gab Fälle von chimären ITS- (VMC38 und VMC50) und SodA-Sequenzen (VMC33). Zwei neuere Veröffentlichungen gehen noch weiter und schlagen jeweils die Sequenzierung eines anderen Satzes von sieben Housekeeping-Genen für die Multilocus-Sequenztypisierung (7) oder die Multilocus-Sequenzanalyse (1) vor. Diese Ansätze beruhen auf der Analyse einer größeren Anzahl von Genen, um eine höhere Auflösung zu erzielen und die Auswirkungen gelegentlicher chimärer oder fremder Gene zu minimieren (1, 7). Diese Schemata ermöglichen auch ausgefeiltere phylogenetische Analysen, als sie mit nur zwei oder drei Genen möglich sind. Wir hatten jedoch gelegentlich Schwierigkeiten mit der Amplifikation und Sequenzierung von pfl und pyk und wenig Erfolg mit zwei der anderen empfohlenen Gene, map und ppaC (1). In einer anderen kürzlich durchgeführten Studie wurden ähnliche Schwierigkeiten berichtet (27). Daher kann die Auswahl zusätzlicher Gene empirische Tests erfordern, aber die in den Sieben-Gene-Analysen verwendeten sollten zuerst untersucht werden, da große Sammlungen von Sequenzen aus gut charakterisierten Stämmen zum Vergleich zur Verfügung stehen (1, 7).

Nach unserem Wissen ist dies erst der zweite Bericht über ein Blutkulturisolat von Streptococcus australis (12) oder S. infantis (30). Die einzige andere Assoziation der letztgenannten Spezies mit einer Krankheit stammt aus zwei Berichten über ihre Isolierung aus dem Sputum von Erwachsenen mit zystischer Fibrose (17, 26). Daher ist es interessant, dass ein Erwachsener mit zystischer Fibrose die Quelle unseres S. infantis-Isolats VMC58 war (siehe Tabelle S2 im ergänzenden Material).

Die Daten zur Antibiotikaempfindlichkeit sind in Tabelle S2 enthalten und stimmen weitgehend mit früheren Studien überein (8). Tabelle S2 enthält auch klinische und demografische Daten für die Ausgangspatienten, wobei sie nach der wichtigsten Grunderkrankung kategorisiert sind: medizinische Krankheit, Malignität, IE oder Operation/Trauma. Alle IE-Patienten wurden klinisch diagnostiziert, und alle außer dem VMC56-Fall (Tabelle S2) wurden nach den modifizierten Duke-Kriterien (16) als „definitive IE“ eingestuft. Die einzige Ausnahme hatte eine Vorgeschichte von IE und intravenösem Drogenkonsum (IVDU), was in Verbindung mit den positiven Blutkulturen zu einer Einstufung als „mögliche IE“ führen würde. Die Daten zu möglichen Infektionsquellen, einschließlich zentraler Leitungen, gastrointestinaler Endoskopie, oraler Mukositis, zahnärztlicher Erkrankungen und IVDU, wurden ebenfalls untersucht. IVDU wurde bei 9 der 13 IE-Patienten und nur bei einem anderen Patienten in der Studie gefunden (Tabelle S2). Dieser Unterschied war statistisch signifikant (P < 0,0001; Fisher’s exact test). Obwohl sich diese Studie auf orale Spezies konzentrierte, war IVDU also ein überwältigender Risikofaktor.

Unsere phylogenetische Analyse ergab keine statistisch signifikanten Assoziationen zwischen einer bestimmten Spezies oder einem klonalen Typ und der zugrunde liegenden Krankheit oder anderen klinischen Parametern, einschließlich der Anzahl der weißen Blutkörperchen, der höchsten Temperatur, der Größe der Vegetation, der betroffenen Klappe oder dem Tod des Patienten. Eine frühere Studie enthielt genügend Informationen, um die von neutropenischen Patienten isolierten Arten zu identifizieren (12). Unsere Ergebnisse waren insofern ähnlich, als es sich bei 11 von 12 Isolaten in dieser Studie und bei 9 von 10 in unserer Studie (Tabelle S2) entweder um S. mitis oder den eng verwandten S. oralis handelte. In unserer Studie war die Wahrscheinlichkeit, dass diese beiden Spezies bei neutropenischen Patienten isoliert wurden, signifikant höher als bei den 12 übrigen Spezies zusammen (P = 0,004; Fisher’s exact test). Dies könnte auf die Prävalenz dieser Spezies in der Mundhöhle zurückzuführen sein. Interessant ist jedoch, dass sich dieser Trend nicht auf den IE übertragen hat. Kombiniert man unsere Daten mit denen aus derselben Studie (12) für Neutropenie und IE, so wurden S. oralis und S. mitis bei 20 von 22 Neutropenie-Fällen und nur bei 15 von 27 IE-Fällen isoliert, ein statistisch signifikanter Unterschied (P = 0,01; exakter Test von Fisher). Wie in früheren Studien (11, 12, 30) war es uns aufgrund der geringen Anzahl der Proben nur begrenzt möglich, andere mögliche Zusammenhänge zwischen den Spezies und bestimmten Krankheiten oder klinischen Merkmalen sicher zu beurteilen. Indem wir jedoch die endgültige Identifizierung der Spezies mit klinischen und demografischen Merkmalen für jeden Ausgangspatienten verknüpften (Tabelle S2), haben wir versucht, unsere Ergebnisse für eine Meta-Analyse oder andere Studien, die kombinierte Daten verwenden, geeignet zu machen.