Plaque Assay

Der Plaque Assay kann zur Reinigung einer klonalen Viruspopulation oder zur Bestimmung des Virustiters in Form von Plaque-bildenden Einheiten pro ml (pfu/ml) verwendet werden, so dass bei nachfolgenden Arbeiten bekannte Virusmengen zur Infektion von Zellen verwendet werden können. Bei diesem Test werden Zellmonolayer mit einem geringen Anteil des Virus infiziert, so dass nur vereinzelte Zellen infiziert werden. Eine Agaroseauflage hält die Zellen stabil und begrenzt die Ausbreitung des Virus. Wenn jede infizierte Zelle Viren produziert und schließlich lysiert, werden nur die unmittelbar benachbarten Zellen infiziert. Jede Gruppe von infizierten Zellen wird als Plaque bezeichnet. Uninfizierte Zellen umgeben die Plaques. Nach mehreren Infektionszyklen beginnen die infizierten Zellen in der Mitte der Plaques zu lysieren, und die peripheren infizierten Zellen bleiben von nicht infizierten Zellen umgeben. Dieses Phänomen bewirkt, dass sich das Licht, das durch die infizierten Zellen fällt, anders bricht als das der umgebenden nicht infizierten Zellen, und die Plaques können entweder mit bloßem Auge oder durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Jede Plaque stellt ein einzelnes Virus dar. Daher können klonale Viruspopulationen durch Isolierung einzelner Plaques gereinigt werden. Einzelne Plaques, die aus unterschiedlichen Verdünnungen einer Virusbrühe gewonnen wurden, können gezählt werden, um den Virustiter (pfu/ml) einer bestimmten Transfektion oder Virusbrühe zu bestimmen. Der Zustand der Zellen und ihre gleichmäßige Verteilung auf der Oberfläche der Gewebekulturplatte sind für den Erfolg eines Plaque-Tests wichtig. Die Zellen sollten zum Zeitpunkt des Tests gesund, > 95 % lebensfähig und in der logarithmischen Wachstumsphase sein. Verklumpte Zellen, Zellen, die nicht gleichmäßig in der richtigen Dichte (>70%) auf der Platte verteilt sind, und Zellen, die nicht innerhalb von 30 Minuten nach dem Ausplattieren an den Gewebekulturschalen haften, beeinträchtigen den Test.

Erforderliche zusätzliche Materialien:

Plaque Assay Agarose, Kat. Nr. 554766
Grace’s Unsupplemented Insect Cell Medium
Fötales Rinderserum
Gewebekulturschale, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Kat. Nr. 353802
42°C Wasserbad

Protokoll

Bestimmen Sie die Anzahl der benötigten Platten

Für jede Co-Transfektion oder jeden Virusbestand (und die Positivkontrolle) machen Sie Duplikate der seriellen Verdünnungen (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Beschriften Sie jede 60-mm-Platte mit der Proben- und Verdünnungsbeschreibung.

Säen Sie die Kulturplatte mit Insektenzellen

1. Säen Sie 2,3 x 10 6 Sf9-Zellen auf jede 60-mm-Platte. Schwenken Sie die Platten vorsichtig hin und her und dann zur Seite, um die Zellen gleichmäßig auf der Plattenoberfläche zu verteilen. Niemals die Platte hin und her schwenken, da dies zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Zellen führt. Nach dem Einsetzen der Platten lassen Sie die Zellen 30 Minuten bis eine Stunde lang anhaften. Bereiten Sie in dieser Zeit die Agarlösung und die viralen Verdünnungen vor. Durch Lichtmikroskopie prüfen, ob die Zellen zu >70% konfluiert und gleichmäßig verteilt sind.

Agaroselösung vorbereiten

Plattierte Zellen werden mit einer 1%igen Agaroselösung in Grace’s Insect Cell Medium, ergänzt mit 10% FBS, überzogen.

1. Zuerst das Wasserbad auf 42°C ausgleichen. Bestimmen Sie das benötigte Gesamtvolumen der Agarlösung: Multiplizieren Sie 4 ml/Platte mit der Anzahl der Plaque-Assays. Von diesem Gesamtvolumen wird die eine Hälfte autoklaviertes dH 2 O + Agarose sein, um eine 2%ige Lösung zu erhalten, und die andere Hälfte wird Grace’s Insect Media sein, ergänzt mit 10% FBS. Um die Menge an Agarose in Gramm zu bestimmen, die benötigt wird, um eine endgültige 1%ige Agaroselösung herzustellen, multiplizieren Sie das Gesamtvolumen mit 0,01. (Beispiel: 10 Platten x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 g.)
2. Die entsprechende Menge autoklaviertes dH 2 O in eine entsprechend große sterile Glasflasche geben. Fügen Sie dann langsam die berechnete Menge Agarose hinzu, während Sie vorsichtig schwenken, um dH 2 O und Agarose zu mischen. Erhitzen Sie die Mischung in der Mikrowelle, bis sie gerade kocht. Nehmen Sie die Flasche heraus und untersuchen Sie die Mischung auf ungelöste Agarose. Sollte dies der Fall sein, erhitzen Sie weiter. Wiederholen Sie den Vorgang, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat (ACHTUNG: Das Gemisch und der damit verbundene Dampf sind sehr heiß und können Verbrennungen verursachen. Verwenden Sie entsprechende Schutzausrüstung/Vorsichtsmaßnahmen). Sobald sich die Agarose vollständig aufgelöst hat, die Flasche locker verschließen und in das 42 °C warme Wasserbad stellen. Die Mischung auf 42°C abkühlen lassen.
3. Grace’s Insect Media erhalten und fötales Rinderserum zu 10% hinzufügen. Beispiel: Für 100 ml Grace’s Insect Media 10 ml FBS hinzufügen. Die Mischung aus Grace’s Media und 10 % FBS in das 42 °C warme Wasserbad stellen.

Virale Serienverdünnungen vorbereiten

1. Für jede Co-Transfektion sechs sterile 15-ml-Röhrchen von 10 -1 bis 10 -6 mit der entsprechenden Probenbeschreibung beschriften. In jedes Röhrchen 2,7 ml TNM-FH-Medium geben. 0,3 ml des Ko-Transfektionsüberstandes in das erste Röhrchen geben, Röhrchen vortexen. Führen Sie serielle Verdünnungen durch, indem Sie 0,3 ml in die nächste Verdünnung geben und jedes Mal eine neue Pipette verwenden.

Infizieren Sie Monolayer-Zellen

1. Zu diesem Zeitpunkt hatten die Zellen ausreichend Zeit, um an der Plattenoberfläche zu haften. Überprüfen Sie mehrere Platten unter dem Lichtmikroskop, um sich zu vergewissern, dass die Zellen zu 70 % konfluiert sind und sich gleichmäßig verteilen.
2. Saugen Sie das Medium mit einer sterilen 200-µl-Pipettenspitze und unter Vakuum vorsichtig von den Zellen ab, wobei Sie mit den doppelten Platten jeder Verdünnung arbeiten. Die Zellschicht nicht zerstören. Geben Sie 1 ml der entsprechenden Virusverdünnung in jede der doppelten Platten und schwenken Sie die Platte vorsichtig hin und her und dann zur Seite, um das Virus gleichmäßig zu verteilen. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen entsprechenden Platten und Verdünnungen.
3. Schütteln Sie die Platten bei Raumtemperatur unter einer sterilen Abzugshaube alle 15 Minuten für eine Stunde.

Beschichten Sie die infizierten Zellen mit Agarose

1. Nach einer Stunde überprüfen Sie, ob die Agaroselösung 42°C hat. Die Lösung sollte so warm sein, dass sie noch flüssig ist, aber kühl genug, um sie in der Hand zu halten. Wenn Sie die Flasche nicht bequem halten können, ist die Lösung zu heiß und wird die Sf9-Zellen abtöten. Vergewissern Sie sich, dass die Grace’s Insect Media w/ 10% FBS 42°C warm ist. Wenn ja, fügen Sie ein gleiches Volumen zur Agarose-Lösung hinzu, um die endgültige Agar-Lösung zu vervollständigen. Mischen Sie die fertige Agarose-Lösung gut durch.
2. Wenn die Lösung fertig ist, geben Sie sie in ein Glasgefäß, das mit Wasser aus dem Wasserbad gefüllt ist. Dies sollte verhindern, dass die Lösung erstarrt, während du sie unter der Haube verwendest. Überprüfen Sie während des Vorgangs regelmäßig die Temperatur des Wassers im Becherglas. Wenn es abkühlt, ersetzen Sie es durch warmes Wasser aus dem Wasserbad.
3. Arbeiten Sie jeweils mit einem Duplikatpaar und saugen Sie das Medium mit einer sterilen 200-µl-Pipettenspitze und Vakuum vorsichtig von den Zellen ab. Die Zellschicht darf nicht zerstört werden. Kippen Sie die Platte während des Absaugens leicht und saugen Sie den Überstand vom Rand der Platte ab. Dies ermöglicht eine optimale Absaugung, ohne die Zellschicht zu stören. Anschließend langsam 4 ml Agarlösung auf jede Platte geben und den Agar erstarren lassen.
4. Wenn der Agar auf allen Platten erstarrt ist, die Platten vorsichtig in eine saubere, luftdichte Inkubationskammer stellen. Die Kammer befeuchten, indem man sterile Gaze und 10 ml steriles Wasser in eine 10-mm-Kulturschale auf dem unteren Gestell der Inkubationskammer legt. Die Kammer verschließen und in einen 27 °C warmen Inkubator stellen. Die Platten 6 bis 10 Tage lang bebrüten.
5. Plaques können sichtbar gemacht werden, indem man die Platten auf einen dunklen Hintergrund stellt und sie mit einer starken Lichtquelle von der Seite beleuchtet oder indem man sie in einem 45°-Winkel in eine Lichtquelle hält. Wenn Sie lernen, wie man eine Plakette identifiziert, kreisen Sie mögliche Plaketten mit einem Marker ein. Sehen Sie mit dem Lichtmikroskop bei schwacher Leistung nach, um zu bestätigen, dass sich im Zellrasen ein Bereich mit einer Lichtung befindet. Visualisieren Sie bei hoher Leistung, um nach infizierten Zellen an der Peripherie der Lichtung zu suchen, dann weniger infizierte Zellen, wenn Sie sich vom Bereich der Lichtung wegbewegen.
6. Um die Visualisierung von Plaques zu erleichtern, überlagern Sie sie mit 3 ml 0,5%iger Agarose (hergestellt wie zuvor beschrieben), die 50 µg/ml Neutralrot enthält. (Bereiten Sie Neutralrot (Sigma N7005) als Stammlösung mit 1 mg/ml in Wasser oder PBS vor. Filtern und sterilisieren und bei 4°C im Dunkeln aufbewahren.) Aushärten lassen und die Platte über Nacht bei 27 °C inkubieren. Neutralrot färbt gesunde Zellen an, und die Plaques erscheinen als klare Bereiche mit einem Durchmesser von etwa 0,5 bis 3 mm vor einem weißen Hintergrund. Da es sich bei Neutralrot um einen lebenswichtigen Farbstoff handelt, ist es wichtig, die Anfärbung vorzunehmen, solange die Zellschicht gesund ist, d. h. 4 bis 7 Tage nach der Infektion.

Plaque-Reinigung aus dem Virusbestand

Um eine ordnungsgemäße Isolierung zu gewährleisten, sollten die Plaques am besten von Platten mit weniger als 50 Plaques entnommen werden. Es sind mehrere Verdünnungen des Virus zu verwenden, um sicherzustellen, dass eine ausreichend geringe Anzahl von Plaques erhalten wird. Die Plaques können mit sterilen Mikropipettenspitzen (1.000 µl) oder Mikrokapillarröhrchen entnommen werden.

Virus aus Plaqueentnahme vermehren

1. Markieren Sie die Platte unter der Plaque mit einem Marker. Entfernen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze einen Agarosepfropfen direkt über der Plaque. Entnehmen Sie auf diese Weise zwischen 10 und 100 Plaques.
2. Setzen Sie jeden Agarosepfropfen in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml Gewebekulturmedium. Eluieren Sie die Viruspartikel aus der Agarose, indem Sie das Röhrchen über Nacht bei 4°C drehen.
3. Geben Sie 200 µl jeder Plaque-Aufnahme in separate Vertiefungen einer 12-Well-Gewebekulturplatte, die mit 2 x 10,5 Zellen pro Vertiefung in 1 ml frischem TNM-FH-Medium ausgesät wurde. Inkubieren Sie die Platten 3 Tage lang bei 27°C.
4. Der Virusüberstand dieses ersten Durchgangs kann gesammelt und 5 Minuten lang bei 1.000 x g bei 4°C zentrifugiert werden, um Trümmer zu entfernen. Bei 4°C aufbewahren.
5. Eine 100 mm Gewebekulturplatte mit 5 x 10 6 Zellen für jedes Plaque-Isolat besäen. Lassen Sie die Zellen anhaften und ersetzen Sie das Medium durch 10 ml frisches TNM-FH-Medium.
6. Geben Sie 200 µl der Passage-1-Bouillon auf die 100-mm-Platte und inkubieren Sie sie 4 Tage lang bei 27 °C. Die verbleibenden 800 µl der Passage-Eins-Bouillon bei 4°C als Reserve aufbewahren.
7. Den viralen Überstand auffangen und zentrifugieren, um Trümmer zu entfernen. Bestimmen Sie den Titer dieser Passage-zwei-Brühe. Wenn der Titer unter 2 x 10 8 pfu/ml bleibt, mit der Baculovirus-Amplifikation fortfahren.