Mitochondriale Biogenese und metabolische Hyperaktivierung begrenzen die Anwendung des MTT-Tests bei der Abschätzung der strahleninduzierten Wachstumshemmung Abschätzung der strahleninduzierten Wachstumshemmung

Veränderungen in der strahleninduzierten metabolischen Lebensfähigkeit korrelieren nicht mit der Wachstumshemmung

Bei der Untersuchung der strahleninduzierten Wachstumshemmung in verschiedenen Zelllinien mit Hilfe des MTT-Tests und der Zählung der Zellzahl, haben wir festgestellt, dass die Ergebnisse der auf der metabolischen Lebensfähigkeit basierenden Assays nicht mit der tatsächlichen Zellzahl zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Strahlenbelastung korrelieren. Der MTT-Assay wird häufig verwendet, da er die Anzahl der lebensfähigen Zellen in einer bestimmten Probe korrekt wiedergibt2,3,4. Wir untersuchten diesen Assay, indem wir die MTT-Werte mit der Zellzahl verglichen. Exponentiell wachsende Zellen wurden ionisierender Strahlung ausgesetzt, um die Wachstumshemmung sowie die metabolische Lebensfähigkeit durch Auszählung der Zellzahlen bzw. die Reduktion des Tetrzoliumsalzes zu Formazan (klassischer MTT-Assay; hier als MTT-Index verwendet) zu analysieren. Zunächst wurden die Zellen verschiedenen Dosen ionisierender Strahlung (2, 3, 5 und 7 Gy) ausgesetzt, um die von der Strahlendosis abhängigen Veränderungen und die Korrelation zwischen Zellzahl und Stoffwechsellebensfähigkeit zu beobachten. Die Menge des gebildeten Formazans (d.h. der MTT-Index) zeigte 48 Stunden nach der Bestrahlung bei allen drei Zelllinien (A549, MDA-MB-231 und HeLa) eine Verringerung um 20 bis 35 % (bei 5 Gy und 7 Gy; ergänzende Abb. 1Ai bis Ci) im Vergleich zu unbestrahlten Zellen, während die Verringerung der Zellzahl im Bereich von 70 bis 90 % lag (ergänzende Abb. 1Aii bis Cii). 1Aii bis Cii), was eindeutig auf eine fehlende Korrelation zwischen der metabolischen Lebensfähigkeit (MTT-Index) und der Wachstumshemmung (Zellzahl) bei allen Strahlungsdosen hinweist; die beiden analysierten Parameter der Strahlungsantwort.

Um die Allgemeingültigkeit dieser Beobachtung zu untersuchen, untersuchten wir außerdem die Beziehung zwischen den Veränderungen der Zellzahlen (Wachstumshemmung) und dem MTT-Index (metabolische Lebensfähigkeit) in 7 nicht-tumorogenen und tumorogenen Zelllinien (NIH/3T3, Raw 264.7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 und MDA-MB-231) bei einer einzigen Dosis (5 Gy), die bei den drei getesteten Zellen eine Wachstumshemmung von fast 50 % auslöste (ergänzende Abb. 1). 24 Stunden nach der Bestrahlung zeigten alle untersuchten Zelllinien entweder Gleichheit mit der Kontrolle oder einen Anstieg des MTT-Index (Abb. 1Ai bis Gi), mit Ausnahme von Raw 264.7 (Abb. 1Bi), das relativ strahlenempfindlich ist. Andererseits wurde unter diesen Bedingungen eine signifikante Abnahme der Zellzahl festgestellt (Abb. 1Aii bis Gii). 48 Stunden nach der Bestrahlung waren die Zellzahlen im Vergleich zur Kontrolle signifikant niedriger und reichten von 43 % (MDA-MB-231, Abb. 1Gii) bis 76 % (Raw 264.7, Abb. 1Bii), während die MTT-Indexwerte nur eine Verringerung um 10 % bzw. 37 % zeigten, mit dem Maximum bei der Zelllinie Raw264.7 (Abb. 1Bi). Wenn die Werte des MTT-Index (Δ OD) mit der entsprechenden Zellzahl normalisiert wurden, zeigte sich eine 1,4- bis 3-fache (in verschiedenen Zelllinien) erhöhte metabolische Lebensfähigkeit pro Zelle (abgeleitete Information) nach 24 und 48 Stunden, die sich nach 48 Stunden in den meisten Zelllinien außer Raw264.7, NIH/3T3 und HeLa-Zellen weiter verringerte, aber signifikant höher blieb als die entsprechende Kontrolle (Abb. 1Aiii bis Giii). Diese Beobachtungen zeigen deutlich, dass die Zellzahl, die das eigentliche Maß für die strahleninduzierte Wachstumshemmung und/oder Zytotoxizität ist, nicht mit dem auf der metabolischen Lebensfähigkeit basierenden (MTT) Assay mit hohem Durchsatz korreliert, der weithin für die schnelle Bewertung der Strahlenreaktion verwendet wird, was offenbar auf die strahleninduzierte erhöhte metabolische Lebensfähigkeit zurückzuführen ist (Abb. 1Aiii bis Giii). 1Aiii bis Giii) der exponierten Zellen zurückzuführen ist.

Strahlenexposition erhöht die metabolische Lebensfähigkeit durch Erhöhung der mitochondrialen Masse

Die erhöhte metabolische Lebensfähigkeit in strahlenexponierten Zellen kann entweder aus hyperaktiven Mitochondrien oder einer erhöhten mitochondrialen Masse resultieren, da die Umwandlung von MTT in Formazan hauptsächlich in Mitochondrien stattfindet7,8,9,10. Es ist bekannt, dass ionisierende Strahlung die mitochondriale Masse und Funktion in exponierten Zellen erhöht20,21. Daher haben wir mit Hilfe der Durchflusszytometrie untersucht, ob die erhöhte mitochondriale Masse für den erhöhten MTT-Index in strahlenbelasteten Zellen verantwortlich ist. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen fanden wir heraus, dass die durchschnittliche mitochondriale Masse pro Zelle 24 und 48 Stunden nach der Strahlenexposition signifikant um das 1,4-fache in MCF-7 (Minimum, Abb. 2Fi) bis zum 4-fachen in Raw 264.7 (Maximum, Abb. 2Bi) erhöht war (Abb. 2Ai bis Gi). Gleichzeitig wurde in den bestrahlten Zellen zu den jeweiligen Zeitpunkten auch eine erhöhte Formazanproduktion pro Zelle beobachtet, die unter ähnlichen Versuchsbedingungen quantifiziert wurde (Abb. 2Aii bis Gii). Die mikroskopischen Bilder 24 Stunden nach der Bestrahlung zeigen ebenfalls eine deutlich erhöhte Formazanablagerung in den bestrahlten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen (Abb. 2Aiii bis Giii). Die formazanhaltigen Körper (Mitochondrien) in den Kontrollzellen haben eine weniger intensive Farbe und sind spärlich und gleichmäßig im Zytoplasma verteilt, während sie in den bestrahlten Zellen dunkel gefärbt und im perinukleären Bereich gehäuft sind (Abb. 2Aiii bis Giii). Diese mikroskopischen Bilder liefern visuelle und unterstützende Beweise für den höheren MTT-Index oder die erhöhte metabolische Lebensfähigkeit pro Zelle in bestrahlten Zellen. Außerdem wird bestätigt, dass eine geringere Anzahl von bestrahlten überlebenden Zellen eine viel höhere Formazanmenge (Farbdichte) pro Zelle produzieren kann als die entsprechenden unbehandelten Kontrollzellen, was zu einer falschen Interpretation der Daten führt.

Bestrahlung erhöht die metabolische Lebensfähigkeit durch Induktion der mitochondrialen Biogenese

Mitochondrien sind der Hauptort, an dem MTT zu Formazan reduziert wird7,8,9,10, daher kann eine Zunahme der mitochondrialen Masse die metabolische Lebensfähigkeit erhöhen. Die erhöhte Mitochondrienmasse in bestrahlten Zellen könnte auf zwei Gründe zurückzuführen sein: Erstens induziert ionisierende Strahlung einen G2/M-Block22,23 Zellen, die in der G2-Phase verhaftet sind, haben eine höhere Anzahl von Mitochondrien22,23,24 , die in bestrahlten Zellen mehr MTT zu Formazan reduzieren können. Zweitens ist bekannt, dass ionisierende Strahlung die mitochondriale Biogenese20,21 anregt, was zu einer erhöhten mitochondrialen Masse führt. Um zu testen, ob der durch die Strahlung induzierte G2/M-Stillstand oder die mitochondriale Biogenese oder beides für die erhöhte mitochondriale Masse pro Zelle in bestrahlten Zellen verantwortlich ist, haben wir beide Hypothesen nacheinander untersucht. Da die strahleninduzierte erhöhte mitochondriale Masse (Abb. 2Ai bis Gi) bei allen Zelllinien beobachtet wurde, wurden nur HeLa- und MDA-MB-231-Zellen zufällig ausgewählt, um die Mechanismen zu verstehen, die der strahleninduzierten erhöhten metabolischen Lebensfähigkeit zugrunde liegen.

Die Zellzyklusverteilung wurde 24 und 48 Stunden nach der Bestrahlung durchgeführt. Nach 24 Stunden wurden 17 bzw. 6 % überschüssige Zellpopulationen in der G2/M-Fraktion des Zellzyklus in HeLa- und MDA-MB-231-Zellen gefunden. Diese Blockade ist jedoch nach 48 Stunden vollständig aufgehoben (Abb. 3A), was darauf hindeutet, dass der durch die Strahlung verursachte Zellzyklus-Stillstand teilweise zu der erhöhten mitochondrialen Masse nach 24 Stunden, nicht aber nach 48 Stunden beiträgt. Es ist auch wichtig festzustellen, dass eine um fast 17 % erhöhte Anzahl von Zellen in der G2/M-Phase nicht zu einer 1,9-fachen (was 90 % entspricht) Veränderung der mitochondrialen Masse und einer 1,5-fachen Veränderung der MTT-Reduktion zu Formazan nach 24 Stunden in HeLa-Zellen führen kann (Abb. 2Di und Dii). Obwohl die Zellzyklusblockade nach 48 Stunden vollständig aufgehoben war, blieben die mitochondriale Masse und die erhöhte metabolische Lebensfähigkeit deutlich höher als bei den entsprechenden Kontrollen. Diese Beobachtungen unterstützen nicht die These, dass die durch Strahlung induzierte erhöhte metabolische Lebensfähigkeit auf einen Zellzyklus-Stillstand zurückzuführen ist, der eine erhöhte mitochondriale Masse vermittelt, wie dies früher bei der Behandlung mit polyphenolischen Verbindungen berichtet wurde18,25.

Um die Hypothese zu testen, dass die durch die Strahlung induzierte hyper-metabolische Aktivität, die mit der erhöhten mitochondrialen Masse in den exponierten Zellen korreliert (Abb. 2Ai bis Gi), auf die durch die Strahlung induzierte mitochondriale Biogenese zurückzuführen ist, analysierten wir die mtDNA-Kopienzahl in den Kontroll- und exponierten Zellen. Die Kopienzahl des Leu t-RNA-Gens wurde für das mitochondriale Genom, das die mtDNA-Kopienzahl kodiert, gemessen und mit dem nukleären pol-gamma normalisiert, indem die semi-quantitative PCR-Methode verwendet wurde. Sowohl HeLa- als auch MDA-MB-231-Zellen zeigten nach 24 Stunden Strahlenbelastung eine um 18% bzw. 31% erhöhte mtDNA-Kopienzahl, die nach 48 Stunden in HeLa noch um 138% und in MDA-MB-231 noch um 21% höher war als in den Kontrollzellen (Abb. 3B). Des Weiteren untersuchten wir die zeitabhängige Expression der Proteine PGC-1α (Peroxisome Proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) und TFAM (Mitochondrial Transcription Factor A) mittels Western Blot. Diese beiden Proteine sind die Hauptregulatoren der mitochondrialen Biogenese und Erhaltung in Zellen26,27,28. Interessanterweise wurde in den Zellen (HeLa und MDA-MB-231), die der Strahlung ausgesetzt waren, ein zeitabhängiger Anstieg der PGC-1α- und TFAM-Expression (Abb. 3C) beobachtet, der mit einer erhöhten mitochondrialen Masse zum Zeitpunkt von 24 Stunden korreliert (Abb. 2Di und Gi). Des Weiteren überprüften wir, ob die erhöhte mitochondriale Masse funktionell ist und eine erhöhte Expression des Proteins SDH-A aufweist, welches das primäre reduzierende Enzym von MTT zu Formazan ist7,8,9,10. Die Proteinkonzentration von SDH-A war nach 8 und 24 Stunden Strahlenbelastung ebenfalls erhöht (Abb. 3C), was mit einem erhöhten MTT-Index oder einer erhöhten metabolischen Lebensfähigkeit in HeLa- und MDA-MB-231-Zellen korreliert (Abb. 1 und 2). Auch bei anderen Zelllinien wurden signifikant erhöhte SDH-A-Werte festgestellt (Daten nicht gezeigt). Um die Hypothese zu bestätigen, dass die strahleninduzierte mitochondriale Biogenese zu einer erhöhten metabolischen Lebensfähigkeit führt, hemmten wir die mitochondriale Biogenese mit Chloramphenicol29,30. Wir fanden heraus, dass Chloramphenicol in einer nicht-toxischen Konzentration die strahleninduzierte mitochondriale Biogenese in beiden Zelllinien signifikant reduzierte (Abb. 3D). Als MTT und Wachstumskinetik (Abb. 3E und F) in Zellen durchgeführt wurden, die vor der Strahlenexposition mit Chloramphenicol behandelt wurden, zeigte sich eine signifikant geringere Formazanbildung als bei alleiniger Bestrahlung (Abb. 3E), was darauf hindeutet, dass die strahleninduzierte erhöhte metabolische Lebensfähigkeit hauptsächlich auf die mitochondriale Biogenese zurückzuführen ist. Der Unterschied zwischen der Kurve der strahleninduzierten Wachstumshemmung, die aus dem MTT-Assay und der Zellzählung gewonnen wurde, beträgt bei den mit Chloramphenicol behandelten Zellen nur 8 % (Abb. 3E und F), bei den HeLa- und MDA-MB-231-Zellen dagegen 25 % bzw. 33 % (Abb. 1Di-ii und Gi-ii). Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese, dass die strahleninduzierte Erhöhung der mitochondrialen Masse und der metabolischen Lebensfähigkeit zu einem großen Teil auf die strahleninduzierte mitochondriale Biogenese zurückzuführen ist, die durch strahleninduziertes PGC-1α und TFAM reguliert wird.

Strahlung induziert Hyperaktivierung von Mitochondrien

In früheren Ergebnissen haben wir beobachtet, dass ionisierende Strahlung die mitochondriale Masse in Zellen induziert, was für die erhöhte metabolische Lebensfähigkeit (MTT-Index) in bestrahlten Zellen verantwortlich zu sein scheint; es ist jedoch bekannt, dass Strahlung auch eine Hyperaktivierung einzelner Mitochondrien in bestrahlten Zellen induziert31. Um festzustellen, ob der erhöhte MTT-Index nur auf eine erhöhte Mitochondrienmasse oder auch auf eine strahleninduzierte Hyperaktivierung der Mitochondrien zurückzuführen ist, haben wir ΔΨm (mitochondriales Membranpotenzial, MMP) durch Fluoreszenzmikroskopie mit TMRM gemessen. Bestrahlte Zellen (nach 24 Stunden) zeigten hellrote punktierte Mitochondrien, was auf ein hohes ΔΨm im Vergleich zur Kontrolle hindeutet (Abb. 4A). Dieses Ergebnis wurde durch eine quantitative Schätzung von ΔΨm unter Verwendung von DiOC6 mittels Durchflusszytometrie weiter validiert. HeLa-Zellen wiesen eine 2,4- bis 2,8-fach erhöhte MMP auf, während MDA-MB-231-Zellen zu beiden Zeitpunkten eine 1,3-fache Veränderung der strahleninduzierten MMP zeigten (Abb. 4B). Dieses hohe mitochondriale Membranpotenzial korreliert mit einer mehrfach höheren Formazanbildung in jedem Mitochondrium der bestrahlten Zellen (Bild in Abb. 2Aiii), was auf eine erhöhte Komplex-II-Aktivität (SDH) hindeutet (Abb. 2Aii bis Gii), die wahrscheinlich auf die strahleninduzierte erhöhte ΔΨm zurückzuführen ist. Diese Beobachtung steht im Einklang mit früheren Erkenntnissen aus anderen Studien, die darauf hindeuten, dass der Komplex II unter Stressbedingungen effizienter bei der Bildung und Aufrechterhaltung von ΔΨm ist32,33. Das erhöhte ΔΨm aufgrund des hyperaktiven Komplexes II sorgt auch für eine erhöhte Aktivität anderer mitochondrialer Dehydrogenasen, die möglicherweise zu einer erhöhten Formazanbildung neben SDH beitragen.

Es wurde festgestellt, dass die durch Succinat angetriebene Oxidation über Komplex-II (SDH) einen wesentlichen Beitrag zur verstärkten mitochondrialen ROS-Erzeugung leistet34. Daher analysierten wir den mitochondrialen Superoxidspiegel in Kontroll- und bestrahlten Zellen, um zu prüfen, ob hypermetabolisch aktive Mitochondrien mehr Superoxidradikale produzieren sollten. Die mit MitoSox (mitochondrialer ROS-Indikator) gefärbten Zellen wurden im Durchflusszytometer analysiert. Bestrahlte Zellen zeigen eine deutlich höhere MitoSox-Fluoreszenz als die entsprechenden Kontrollzellen. Beide Zelllinien zeigten nach 24 Stunden einen fast 1,25-fachen Anstieg der mitochondrialen ROS, der jedoch 48 Stunden nach der Bestrahlung auf das 1,65-fache in HeLa- und das 1,5-fache in MDA-MB-231-Zellen anstieg (Abb. 4C). Da die mitochondriale Dehydrogenase SDH am stärksten zur MTT-Reduktion beiträgt7,8,9,10, bestätigen diese Ergebnisse die Beobachtung, dass eine erhöhte ROS direkt proportional zur erhöhten SDH-Aktivität ist34. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die erhöhte Mitochondrienmasse aus funktionell hyperaktiven Mitochondrien besteht, die in bestrahlten Proben eine größere Menge MTT in Formazan pro Zelle reduzieren.

Bestrahlung induziert Kalziumakkumulation in Mitochondrien

Ionisierende Strahlung stört die zelluläre Kalziumhomöostase, was zu einer verstärkten Freisetzung von Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) in das Zytoplasma führt, das dann von funktionellen Mitochondrien in der perinukleären Region der Zellen gepuffert wird35,36. Eine veränderte Kalziumhomöostase induziert auch die Produktion von ROS (reaktive Sauerstoffspezies) und die mitochondriale Biogenese35,36,37.

Um zu untersuchen, ob die nach 24 und 48 Stunden beobachtete erhöhte metabolische Lebensfähigkeit auf einen erhöhten zytoplasmatischen und mitochondrialen Ca2+-Spiegel zurückzuführen ist, wurde das freie zelluläre und mitochondriale Ca2+ geschätzt. Die Kontrollzellen und die behandelten Zellen wurden zu den jeweiligen Zeitpunkten mit Fluo-3AM (Ca2+-Indikator) und Rhod-2AM (spezifischer mitochondrialer Ca2+-Indikator)38 angefärbt und im Durchflusszytometer analysiert. In den bestrahlten Zellen wurde ein signifikanter Anstieg des Kalziumspiegels beobachtet, der in beiden untersuchten Zelllinien (HeLa und MDA-MB-231) um fast das 1,4-fache (40 %) anstieg, wie die erhöhte Fluo-3-Fluoreszenz nach 8 Stunden nahelegt, die nach 24 Stunden geringfügig abnimmt (Abb. 5A). Interessanterweise wurde ein noch stärkerer strahleninduzierter Anstieg des mitochondrialen Ca2+ (2,4-fach in HeLa und 1,6-fach in MDA-MB-231, Abb. 5B) festgestellt. Diese Beobachtung wurde weiter verifiziert, indem die gefärbten Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wurden. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Strahlenbehandlung unabhängig voneinander mit Mitotracker Red, Fluo-3AM und Rhod-2AM angefärbt. Fluo-3AM und Rhod-2AM zeigen beide eine starke perinukleäre punktierte Fluoreszenz mit dem gleichen Muster wie Mitotracker Rot in den entsprechenden bestrahlten Zellen (Abb. 5C), was darauf hindeutet, dass sich vermehrt zytoplasmatisches Ca2+ in den Mitochondrien ansammelt. Darüber hinaus bestätigen spezifische Ca2+-Signale aus Mitochondrien in Rhod-2AM gefärbten Zellen diese Beobachtung. Interessanterweise zeigten MDA-MB-231-Zellen bereits in den Kontrollzellen einen hohen mitochondrialen Ca2+-Gehalt (Rhod-2-AM-Färbung) und eine perinukleäre mitochondriale Anhäufung (Mitotracker-Rot-Färbung), die nach der Bestrahlung noch weiter zunimmt, was der Grund dafür sein könnte, dass diese Zellen anschließend den geringsten Anstieg der strahleninduzierten mitochondrialen Biogenese und Formazanbildung zeigten. In unserer früheren Studie haben wir gezeigt, dass Strahlung eine Anhäufung von Ca2+ in den Mitochondrien verursacht, was zu mitochondrialer Schädigung und Mitophagie führt36. Mitochondrien mit hohem Ca2+ und erhöhtem mitochondrialem Membranpotenzial akkumulieren mehr A23187 und zeigen unter dem Mikroskop bei UV-Anregung eine hellere Fluoreszenz. Dauerhaft geschädigte Mitochondrien zeigen jedoch eine sehr hohe Fluoreszenz und erscheinen als runde Körper in der Zelle36. Um die Ca2+-Akkumulation in Mitochondrien unter diesen experimentellen Bedingungen zu beobachten, färbten wir Kontroll- und bestrahlte HeLa- und MDA-MB-231-Zellen 24 Stunden nach der Exposition (Abb. 5C). Bestrahlte Zellen zeigten auch eine höhere Anhäufung von Körpern, was auf strahleninduzierte geschädigte Mitochondrien hinweist. Bestrahlte Zellen zeigen eine höhere Mitotracker-Rot-, Fluo-3AM- und Rhod-2AM-Fluoreszenz in der perinukleären Region (Abb. 5C), wo die Mitochondrien ein Netzwerk mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER) bilden und den größten Teil der stressinduzierten Ca2+-Leckagen aus dem ER akkumulieren und die Zellen vor dem Tod schützen39. Dieser Befund deutet darauf hin, dass das nach einer Strahlenbelastung aus den Speichern freigesetzte Ca2+ hauptsächlich in den Mitochondrien akkumuliert wird. Es wurde bereits berichtet, dass ein hoher Ca2+-Gehalt in der Mitochondrienmatrix die SDH-Aktivität steigert40. Daher korrelieren wir damit, dass in den Mitochondrien akkumuliertes Ca2+ die SDH-Komplexaktivität erhöht, was zu hyperaktiven Mitochondrien und erhöhter metabolischer Lebensfähigkeit in strahlenexponierten Zellen führt.

Kalziumakkumulation in Mitochondrien führt zu einem hyperaktiven Stoffwechselzustand der Zellen

Um die Rolle von Ca2+ bei der verstärkten Formazanbildung zu untermauern, haben wir außerdem getestet, ob eine Ca2+-Störung in den Zellen allein die metabolische Lebensfähigkeit erhöhen kann. Um dies zu testen, wurden die Zellen eine Stunde lang mit dem Ca2+-Ionophor A23187 (2 µM, der das zytoplasmatische Ca2+ erhöht, genau wie ionisierende Strahlung) behandelt und die metabolische Lebensfähigkeit 4, 8 und 24 Stunden nach der Behandlung analysiert. Interessanterweise zeigten die mit A23187 behandelten Zellen eine signifikant erhöhte (1,6-fache) metabolische Lebensfähigkeit pro Zelle 8 & 24 Stunden in HeLa und 4 & 8 Stunden in MDA-MB-231 (Abb. 6A) nach der Behandlung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass erhöhtes zytoplasmatisches Ca2+ die metabolische Lebensfähigkeit erhöht, indem es die Akkumulation von Ca2+ in den Mitochondrien verstärkt (Abb. 5C). Wir überprüften auch, ob die Hemmung der Ca2+-Akkumulation in den Mitochondrien die strahleninduzierte Zunahme der Mitochondrienmasse hemmen kann. Interessanterweise stellten wir fest, dass Zellen, die mit dem Inhibitor des mitochondrialen Ca2+-Uniporters, Ruthenium Red (RuR, das die Akkumulation von Ca2+ in Mitochondrien hemmt) behandelt wurden, im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung einen signifikant geringeren Anstieg des Mitochondriengehalts (strahleninduziert) zeigten (Abb. 6B). Es ist bekannt, dass erhöhtes Ca2+ die mitochondriale Biogenese durch CaMKII (Calmodulin Kinase-II) induziert37,41, das ebenfalls ein mitochondriales residentes Protein ist, von dem bekannt ist, dass es die PGC-1α-Expression reguliert37,41,42. Daraus schließen wir, dass die Hemmung der Ca2+-Akkumulation in den Mitochondrien durch Rutheniumrot die mitochondriale Masse reduziert, wahrscheinlich durch Hemmung der mitochondrialen Biogenese. Um zu überprüfen, ob die durch die Strahlung induzierte Erhöhung des zytoplasmatischen Ca2+ und seine Anreicherung in den Mitochondrien zu einer erhöhten metabolischen Lebensfähigkeit in bestrahlten Zellen führt, behandelten wir die Zellen 30 Minuten vor der Bestrahlung mit BAPTA-AM (einem intrazellulären Calcium-Chelator) und RuR. Die Chelatisierung von erhöhtem zytoplasmatischem Ca2+ mit BAPTA-AM (Abb. 6C) und die Hemmung der Ca2+-Akkumulation in den Mitochondrien mit RuR (Abb. 6D) hoben beide die strahleninduzierte erhöhte metabolische Lebensfähigkeit nach 24 und 48 Stunden Bestrahlung in HeLa- und MDA-MB-231-Zellen auf (Abb. 6C und D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die strahleninduzierte Störung der Ca2+-Homöostase auch eine wichtige Rolle bei der Hyperaktivierung der Mitochondrien und der erhöhten metabolischen Lebensfähigkeit spielt, wahrscheinlich im Vorfeld der mitochondrialen Biogenese.