Abbildung 2(a) zeigt das Fluoreszenz-Emissionsprofil unter Verwendung des DAPI-FITC-Filterblocks und einer Kultur indischer Muntjac-Hirschfibroblastenzellen, die mit Alexa Fluor 488 gefärbt wurden, das mit Phalloidin konjugiert ist, das an das intrazelluläre filamentöse Aktin-Netzwerk bindet. Das Absorptionsmaximum des sichtbaren Lichts von Alexa Fluor 488 liegt bei 495 Nanometern und das Emissionsmaximum bei 519 Nanometern im grünen Bereich des Spektrums. Zusätzlich wurde die Probe gleichzeitig mit DAPI (für die DNA im Zellkern; Anregung bei 358 Nanometern und Emission bei 461 Nanometern) und MitoTracker Red CMXRos (für die Mitochondrien; rote Emission) gefärbt. Man beachte das Fehlen des Signals des roten Fluorophors (MitoTracker), aber das Vorhandensein der hellgrünen Fluoreszenz der Aktinfilamente und des etwas schwächeren blauen Signals von DAPI im Zellkern.
Ein Dünnschnitt des Mäusedarms, gefärbt mit Alexa Fluor 350 Weizenkeimagglutinin, einem blau fluoreszierenden Lektin, das spezifisch für den Schleim der Becherzellen ist, ist in Abbildung 2(b) dargestellt. Darüber hinaus wurde die Probe gleichzeitig mit Alexa Fluor 568 Phalloidin (filamentöses Aktin; 600 Nanometer Emission) und SYTOX Green (Zellkerne; 504 Nanometer Anregung und 523 Nanometer Emission) gefärbt. Beachten Sie die geringe Signalstärke des blauen Fluorophors (Alexa Fluor 350), aber die helle grüne Fluoreszenz der Zellkerne in der Gewebeprobe aufgrund der SYTOX Green-Fluoreszenz. Diese duale Anregungsfilterkombination eliminiert effektiv das Signal der roten Sonde (Alexa Fluor 568).
Abbildung 2(c) zeigt die Fluoreszenzemissionsintensität einer Kultur von Ratten-Känguru-Epithelzellen (PtK2), die mit primären monoklonalen Anti-Rinder-Alpha-Tubulin-Maus-Antikörpern immunfluoreszierend markiert wurden, gefolgt von Ziegen-Anti-Maus-Fab-Fragmenten, die mit Alexa Fluor 488 konjugiert sind. Zusätzlich wurde die Probe mit Hoechst 33258 markiert, das selektiv an die DNA im Zellkern bindet, sowie mit MitoTracker Red CMXRos (für die Mitochondrien; rote Fluoreszenz). Beachten Sie die auffällige Grünfärbung des intrazellulären Mikrotubuli-Netzwerks, das sich über das gesamte Zytoplasma erstreckt, und die blaue Emission von Hoechst 33258, das an die DNA im Zellkern gebunden ist. Die Zelle im unteren Teil des Bildes scheint sich in der Metaphase oder Prometaphase in der Mitose zu befinden.
Schweizer Mauszellen (3T3-Linie), die mit primären monoklonalen Anti-Zytochromoxidase-Maus-Antikörpern immunfluoreszierend markiert wurden, gefolgt von Ziegen-Anti-Maus-Fab-Fragmenten, die mit Alexa Fluor 568 konjugiert sind, sind in Abbildung 2(d) dargestellt. Die Probe wurde außerdem mit mehreren zusätzlichen Sonden markiert, darunter das Lektin Helix pomatia agglutinin (HPA), das mit Alexa Fluor 488 (grüne Emission) konjugiert ist und selektiv an Glykoproteine im Golgi-Apparat dieser Zelllinie bindet. Die Aktinfilamente des Zytoskeletts wurden mit Alexa Fluor 680 (rote Anregung; Emission im nahen Infrarot) angefärbt, und die Kern-DNA wurde mit DAPI (blaue Emission) markiert. Man beachte die auffällige Grünfärbung des Golgi-Apparats und die blaue Fluoreszenzintensität in den Kernen.
Die Fluoreszenzemission eines mit mehreren (3) Fluorophoren gefärbten Dünnschnitts einer Mausniere ist in Abbildung 2(e) dargestellt. Die Kerne im Gewebeschnitt wurden mit der Nukleinsäuresonde DAPI angefärbt, die ein Anregungsmaximum bei 358 Nanometern und ein Emissionsmaximum bei 461 Nanometern aufweist, wenn sie an DNA in Zellkulturen und Gewebeschnitten gebunden ist. Zusätzlich wurde der Kryostatschnitt gleichzeitig mit Alexa Fluor 488 Weizenkeimagglutinin (Glomeruli und Tubuli) und Alexa Fluor 568 Phalloidin (filamentöses Aktin und Bürstensaum) gefärbt. Man beachte das Vorhandensein von Signalen sowohl der blauen (DAPI) als auch der grünen (Alexa Fluor 488) Sonden, aber das Fehlen von orange-roter Fluoreszenz aufgrund von Alexa Fluor 568-Konjugaten in den Aktin- und Bürstensaum-Netzwerken.
Autofluoreszenzemission von einem Maiskorn (Zea mays) Dünnschnitt ist in Abbildung 2(f) dargestellt. Die endogene Autofluoreszenz in pflanzlichen Geweben stammt von einer Vielzahl von Biomolekülen, darunter Chlorophyll, Karotin und Xanthophyll. Im ultravioletten und blauen Anregungsbereich hat Chlorophyll eine Absorptionsbande mit einem hohen Extinktionskoeffizienten und erzeugt eine erhebliche Menge an Fluoreszenz, wenn es mit Wellenlängen zwischen 350 und 500 Nanometern angeregt wird. Beachten Sie bei dem oben abgebildeten Maiskorngewebe die Intensität der Autofluoreszenzemission im blauen und grünen Spektralbereich, die für die Nikon-Fluoreszenzfilterkombination DAPI-FITC charakteristisch ist.