Van ‚t Hoff erwarb seinen ersten Ruf auf dem Gebiet der organischen Chemie. 1874 erklärte er das Phänomen der optischen Aktivität, indem er annahm, dass die chemischen Bindungen zwischen Kohlenstoffatomen und ihren Nachbarn auf die Ecken eines regelmäßigen Tetraeders ausgerichtet sind. Diese dreidimensionale Struktur war die Erklärung für die in der Natur vorkommenden Isomere. Dies ist auch das Verdienst des französischen Chemikers Joseph Le Bel, der unabhängig davon dieselbe Idee hatte.
Drei Monate vor seiner Promotion veröffentlichte Van ‚t Hoff diese Theorie, die heute als Grundlage der Stereochemie gilt, im Herbst 1874 zunächst in einer niederländischen Broschüre und im darauf folgenden Mai in einem kleinen französischen Buch mit dem Titel La chimie dans l’espace. Eine deutsche Übersetzung erschien 1877, zu einer Zeit, als Van ‚t Hoff nur eine Stelle an der Veterinärschule in Utrecht finden konnte. In diesen frühen Jahren wurde seine Theorie von der wissenschaftlichen Gemeinschaft weitgehend ignoriert und von einem prominenten Chemiker, Hermann Kolbe, scharf kritisiert. Kolbe schrieb:
„Ein Dr. J. H. van ‚t Hoff von der Tierarzneischule in Utrecht hat offenbar keine Vorliebe für exakte chemische Untersuchungen. Er hat es für bequemer gehalten, auf den Pegasus zu steigen (anscheinend von der Tierarzneischule geliehen) und in seinem ‚La chimie dans l’espace‘ zu verkünden, wie ihm bei seinem kühnen Flug zum Gipfel des chemischen Parnass die Atome im kosmischen Raum angeordnet erschienen.“
Um 1880 jedoch brachte die Unterstützung der Theorie van ‚t Hoffs durch so bedeutende Chemiker wie Johannes Wislicenus und Viktor Meyer Anerkennung.
1884 veröffentlichte Van ‚t Hoff seine Forschungen zur chemischen Kinetik unter dem Titel Études de Dynamique chimique („Studien zur chemischen Dynamik“), in denen er eine neue Methode zur Bestimmung der Reihenfolge einer Reaktion anhand von Grafiken beschrieb und die Gesetze der Thermodynamik auf chemische Gleichgewichte anwendete. Er führte auch das moderne Konzept der chemischen Affinität ein. 1886 wies er eine Ähnlichkeit zwischen dem Verhalten von verdünnten Lösungen und Gasen nach. 1887 gründete er zusammen mit dem deutschen Chemiker Wilhelm Ostwald eine einflussreiche wissenschaftliche Zeitschrift mit dem Namen Zeitschrift für physikalische Chemie“. Er arbeitete an der Theorie von Svante Arrhenius über die Dissoziation von Elektrolyten und lieferte 1889 die physikalische Begründung für die Arrhenius-Gleichung. Im Jahr 1896 wurde er Professor an der Preußischen Akademie der Wissenschaften in Berlin. Seine Studien über die Salzlagerstätten in Stassfurt waren ein wichtiger Beitrag zur chemischen Industrie Preußens.
Van ‚t Hoff wurde Dozent für Chemie und Physik an der Tierärztlichen Hochschule in Utrecht. Anschließend arbeitete er fast 18 Jahre lang als Professor für Chemie, Mineralogie und Geologie an der Universität Amsterdam, bevor er schließlich Vorsitzender der chemischen Fakultät wurde. Im Jahr 1896 zog Van ‚t Hoff nach Deutschland, wo er seine Karriere 1911 an der Universität Berlin beendete. Im Jahr 1901 erhielt er den ersten Nobelpreis für Chemie für seine Arbeit mit Lösungen. Seine Arbeit zeigte, dass sehr verdünnte Lösungen mathematischen Gesetzen folgen, die den Gesetzen, die das Verhalten von Gasen beschreiben, sehr ähnlich sind.