Immunoassay-Screening von Diphenhydramin (Benadryl®) in Urin und Blut Using a Newly Developed Assay

Chemische Strukturen von Antihistaminika.

Traditionelle Methoden zur Untersuchung von DPH in menschlichem Plasma beinhalteten eine teure und zeitaufwendige Probenextraktion, gefolgt von Bestätigungsverfahren. Mehrere Gruppen haben über den Einsatz verschiedener gaschromatographischer (GC) Methoden zum Nachweis von DPH in Plasma und Urin berichtet (23-27). Es gibt auch Berichte über Kapillarelektrophorese (28) und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) (29), die für den Nachweis von DPH entwickelt wurden. Bislang gibt es in der Literatur keine Berichte über das Screening auf Diphenhydramin mittels ELISA oder einer anderen Immunoassay-Methode. In dieser Veröffentlichung berichten wir über die erste ELISA-Screening-Methode für DPH in menschlichem Urin und Blut.

Es gilt als Standardverfahren in Toxikologielabors, einen Immunoassay-Screen durchzuführen, bei dem positive Proben zunächst identifiziert und anschließend durch GC-MS- oder LC-MS-Techniken bestätigt werden. Dies wird von den meisten toxikologischen Labors als „Kosten-Nutzen“-Strategie angewandt, im Gegensatz zur Durchführung eines teureren Bestätigungsverfahrens bei jeder erhaltenen Probe. Daher wäre eine zuverlässige ELISA-Screening-Methode für die Anwendung auf DPH-Proben im Zusammenhang mit Verkehrsunfällen und Todesfällen von Nutzen. Um dieses Ziel zu erreichen, haben Toxikologen Empfehlungen für DUID vorgelegt, einschließlich eines vorgeschlagenen DPH-Grenzwertes von 25 ng/ml im Blut und 50 ng/ml im Urin (30). In dieser Arbeit wird eine robuste und genaue ELISA-Screening-Methode für DPH in menschlichem Urin und Blut beschrieben, die diesen vorgeschlagenen Richtlinien folgt.

Experimentell

Materialien

Reagenzien und Chemikalien. Diphenhydramin wurde von Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI) bezogen, und Diphenhydramin-d3 (100 μg/mL Lösung in Methanol) wurde von Cerilliant (Round Rock, TX) bezogen. Der DPH-spezifische polyklonale Antikörper wurde von Immunalysis (Pomona, CA) hergestellt, und die DPH-Haptene und mit Meerrettichperoxidase markierten Konjugate wurden von Immunalysis synthetisiert. Das für die kolorimetrische Reaktion verwendete Substratreagenz 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) wurde von Pierce (Rockford, IL) bezogen. Als Enzyme wurden Rinderthyroglobulin (BTG) von Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), Meerrettichperoxidase (HRP) von BBI Enzymes (Madison, WI) und Rinderserumalbumin (BSA) von Proliant Biologicals (Boone, IA) verwendet. Alle verwendeten Lösungsmittel waren HPLC-Qualität, und alle Chemikalien waren ACS-Qualität und wurden von Spectrum Chemicals (Gardena, CA) bezogen. Für den ELISA wurden die Hochkalibratoren für DPH bei 1000 ng/ml in synthetischem negativem Urin und synthetischem negativem Blut hergestellt und bei 4 °C gelagert. Der synthetische Negativurin und das synthetische Negativblut, die in diesem Test verwendet wurden, wurden mit Inhaltsstoffen formuliert, die in den jeweiligen Matrices enthalten sind, und entsprachen den Immunoassay-Reaktionen von drei negativen menschlichen Urin- und Blutproben (31, 32). Synthetischer negativer Urin besteht aus einer 0,1%igen BSA-Lösung in deionisiertem Wasser; mit 0,2% FD&C gelb #6 Farbstoff, und synthetisches negatives Blut besteht aus einer firmeneigenen Immunalysis-Formulierung.

Gerät. HiTrap Protein G HP Affinitätssäulen, die für die Reinigung von Immunglobulin G (IgG) verwendet wurden, wurden von GE Healthcare (Pittsburgh, PA) erworben. Standard-Mikrotiterplatten aus Polystyrol (96 Vertiefungen) wurden von Corning Costar (Corning, NY) bezogen. Ein Tecan Columbus Pro Mikrotiterplatten-Waschgerät und ein Tecan Sunrise Plattenlesegerät wurden beide von Tecan (San Jose, CA) bezogen. Die Pipetten, die während des Entwicklungsprozesses des Immunoassays verwendet wurden, stammen alle von Rainin Instruments (Oakland, CA). Ein 6410 Triple-Quadrupol-MS und die für die LC-MS-MS-Analyse verwendete Zorbax Eclipse XDB C18-Säule wurden beide von Agilent Technologies (Santa Clara, CA) bezogen.

Methoden

ELISA. Der erste Schritt bei der Entwicklung der ELISA-Methode bestand in der Herstellung polyklonaler Antikörper, die auf der immunochemischen Reaktion einer ausgewählten Tierart auf ein DPH-spezifisches Antigen basierten. Zu diesem Zweck wurden Kaninchen zunächst mit einem DPH-Antigen immunisiert, das aus DPH besteht, das mit Rinderthyroglobulin (BTG) konjugiert ist. Der Prozess der Immunisierung und Entblutung der Kaninchen wurde an eine spezialisierte Tierklinik ausgelagert. Das von den Kaninchen gewonnene Serum wurde intern durch Affinitätschromatographie mittels Elution über Protein-G-Säulen gereinigt, um die gereinigte IgG-Fraktion zu erhalten. Das DPH-spezifische polyklonale IgG wurde dann auf Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen immobilisiert. Der überschüssige Antikörper wurde abgesaugt, die freien Antikörperbindungsstellen mit einer 1%igen Trehaloselösung in Wasser blockiert und die Platten anschließend über Nacht bei 37°C im Vakuumofen getrocknet. Die Platten wurden anschließend in einem versiegelten Beutel mit Trockenmittel aufbewahrt, da es wichtig ist, sie vor Feuchtigkeit zu schützen. Eine DPH-Urin-Dosis-Wirkungs-Kurve wurde zunächst durch Anreicherung von negativem synthetischem Urin mit 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 und 500 ng/ml aus der Hochkalibrator-Stammlösung des Arzneimittels erstellt. Die Blutkurve wurde durch Anreicherung von negativem synthetischem Blut mit 1, 5, 10, 25, 50, 100 und 250 ng/ml aus der Hochkalibratorlösung gewonnen. Diese Kalibratoren im synthetischen Blut wurden dann vor der Analyse im Verhältnis 1:10 mit 100 mM Phosphatpuffer mit 150 mM Natriumchlorid (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,0) weiter verdünnt. Alle Blutproben wurden in ähnlicher Weise 1:10 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,0) verdünnt. Urinproben wurden ebenfalls im Verhältnis 1:20 mit 100 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,0) verdünnt. Kalibratoren und Proben wurden dann in zweifacher Ausführung in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert, wobei eine Probengröße von 10 μl sowohl für Urin als auch für Blut verwendet wurde. Anschließend wurden 100 μl des Enzymkonjugats, bestehend aus Diphenhydramin, das mit HRP markiert ist, hinzugefügt. Die Platte wurde dann 1 Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur bebrütet. Anschließend wurden die Vertiefungen sechsmal mit 350 μl entionisiertem Wasser gewaschen, abgesaugt, um Wasser zu entfernen, umgedreht und trocken geklopft, um Restwasser aus den Vertiefungen zu entfernen. Anschließend wurde das chromogene TMB-Substrat (100 μl) in jede Vertiefung gegeben und die Platte für weitere 30 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde dann mit 100 μl 1-N-Salzsäure gestoppt, um eine gelbe Farbe zu erzeugen. Der Test ist kolorimetrisch, und die Absorption wurde bei einer doppelten Wellenlänge von 450 nm und 650 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen. Die Wellenlänge von 650 nm misst die Hintergrund-Extinktion, die der Plattenleser dann von der endgültigen Extinktion abzieht. Die Intensität der erzeugten Farbe ist umgekehrt proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe.

LC-MS-MS. Für die Analyse wurde eine LC-Pumpe der Serie 1200 verwendet, die mit einem 6410 Triple-Quadrupol-MS gekoppelt ist, das im positiven Elektrospray-Ionisierungsmodus (ESI) arbeitet. Die verwendete LC-MS-MS-Säule war eine Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). Die Probe für die Analyse wurde wie folgt vorbereitet: Eine 100-µL-Urinprobe mit 50 µL Diphenhydramin-d3 (200 ng/mL) wurde in ein Autosampler-Fläschchen gegeben. Die Proben wurden über einen Autoinjektor direkt in das LC-MS-MS injiziert. Die Säulentemperatur wurde auf 60°C gehalten, und das Injektionsvolumen betrug 5 µL. Die mobile Phase bestand aus 0,2 % Essigsäure pH 4 (Lösungsmittel A) und Methanol (Lösungsmittel B). Zunächst betrug die Zusammensetzung der mobilen Phase 100 % A bei einer Durchflussrate von 0,7 mL/min über einen Zeitraum von 6 min, dann wurde der Methanolanteil auf 100 % erhöht und nach 7 min wieder auf 100 % A zurückgeführt.

Die Gastemperatur betrug 350 °C, der Gasfluss 10 l/min und der Zerstäuberdruck wurde auf 50 psi gehalten. Als Kollisionsgas wurde Stickstoff verwendet, und die Kapillarspannung betrug 4000 V. Für jedes Medikament wurden zwei Übergänge ausgewählt und optimiert. Die Verweilzeit betrug 50 ms, und die optimale Fragmentorenergie betrug 80 V für alle Übergänge. Die optimalen Kollisionsenergiespannungen wurden mit 35 V für den deuterierten internen Standard (Diphenhydramin-d3), 15 V für den primären Übergang und 30 V für den sekundären Übergang für Diphenhydramin selbst bestimmt. Das Verhältnis des Qualifier-Übergangs zum Quantifier-Übergang wurde ungefähr in der Mitte des Kalibrierbereichs bestimmt: 100 ng/mL. Der Übergang für Diphenhydramin-d3 war 259,7 > 165,2; der primäre (quantifizierende) Übergang für Diphenhydramin war 256,7 > 167,2; der qualifizierende (sekundäre) Übergang 256,7 > 152,2. Unmarkiertes Diphenhydramin kann je nach der angewandten Kollisionsenergie vom Vorläufer-Ion in Produkt-Ionen mit m/z 167 oder 165 zerfallen. Unser Verfahren wurde unter den beschriebenen Bedingungen validiert. Die Nachweisgrenze (LOD) der LC-MS-MS-Methode betrug 10 ng/mL und wurde als niedrigste nachweisbare Konzentration mit einem Signal/Rausch-Verhältnis > 2 bestimmt.

Ergebnisse und Diskussion

Dosis-Wirkungs-Kurve

Die Methode beruht auf einer kompetitiven Bindung zwischen dem Enzymkonjugat und dem freien Analyten in der Probe für eine feste Menge von Antikörper-Bindungsstellen, die proportional zu ihrer Konzentration in der Mischung ist. Die Dosis-Wirkungs-Kurven für DPH wurden in synthetischem negativem Urin und synthetischem negativem Blut bei den zuvor beschriebenen Konzentrationen erstellt. B0 ist die Absorption des negativen Kalibrators, und B steht für die Absorption der einzelnen Kalibratorniveaus. Das prozentuale Verhältnis von individuellem Kalibrator zu negativem Kalibrator (B/B0) wurde für jedes Kalibratorniveau berechnet und gegen die Drogenkonzentration (ng/ml) sowohl für Urin als auch für Blut aufgetragen (Abbildung 3). Die B/B0-Werte sind umgekehrt proportional zur Drogenkonzentration in der Probe, denn je höher die Drogenkonzentration ist, desto weniger bindet das Drogen-Enzym-Konjugat an den Antikörper, was zu einem niedrigeren Absorptionswert führt.