Die Immunhistochemie (IHC) ist eine leistungsstarke mikroskopische Technik zur Visualisierung zellulärer Komponenten, beispielsweise von Proteinen oder anderen Makromolekülen in Gewebeproben. Die Stärke der IHC liegt in der intuitiven visuellen Darstellung, die das Vorhandensein und die Lokalisierung des Zielproteins im Kontext verschiedener Zelltypen, biologischer Zustände und/oder subzellulärer Lokalisierung in komplexen Geweben erkennen lässt.
Die IHC-Technik wurde in den 1940er Jahren erfunden (Coons, Creech, & Jones, 1941) und wird routinemäßig als wichtiges Instrument im Gesundheitswesen und in der Pathologie eingesetzt, z. B. zu diagnostischen Zwecken oder zur Stratifizierung von Patienten für optimierte Behandlungsverfahren. IHC wird auch in der Forschung häufig eingesetzt, wo Moleküle von Interesse analysiert werden, um ihre Rolle in gesunden und kranken Zellen und Geweben auf molekularer, zellulärer oder Gewebeebene zu untersuchen. Es gibt viele verschiedene Möglichkeiten, Zielmoleküle in Geweben mit IHC oder IHC-basierten Methoden sichtbar zu machen, und es gibt zahlreiche Protokolle für verschiedene Anwendungen und Tests. Auch wenn die IHC im Allgemeinen eine robuste und etablierte Methode ist, müssen neue Assays je nach Gewebe oder den Eigenschaften des Zielproteins, des Bindemoleküls und/oder des Reportersystems häufig sorgfältig optimiert werden. Viele Jahre der technischen Entwicklung und die enorm gestiegene Verfügbarkeit spezifischer Bindemoleküle haben den Nutzen und die Anwendungsbereiche der IHC erheblich verbessert. Die Fortschritte auf dem Gebiet der IHC-Techniken und -Reagenzien haben Wissenschaftlern und Gesundheitsdienstleistern präzisere Instrumente, Assays und Biomarker an die Hand gegeben. Darüber hinaus haben technische Fortschritte z. B. den hochempfindlichen gleichzeitigen Nachweis mehrerer Proteine in derselben Probe und den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen ermöglicht (siehe Proximity Ligation Assay).
Der klassische IHC-Assay ist in Abbildung 1 dargestellt und umfasst den Nachweis von Epitopen, die von einem einzelnen Protein-Target in einer Gewebeprobe exprimiert werden, unter Verwendung eines „primären Antikörpers“, der diese Epitope mit hoher Spezifität binden kann. Nach dem Epitop-Antikörper-Bindungsereignis wird ein „sekundärer Antikörper“ hinzugefügt, der den primären Antikörper mit hoher Spezifität binden kann. Der sekundäre Antikörper ist an ein Reportermolekül gekoppelt, und nach dem Antikörper-Antikörper-Bindungsereignis wird ein chemisches Substrat zugegeben, das mit dem Reportermolekül reagiert, um an der Stelle des gesamten Epitop-Antikörper-Komplexes ein farbiges Präzipitat zu erzeugen.
Abbildung 1. Das Grundprinzip der Immunhistochemie.
In der schematischen Darstellung (Abbildung 1) wird ein formalinfixierter, in Paraffin eingebetteter Gewebeschnitt mit einem primären Antikörper angefärbt, der gegen ein spezifisches Proteinziel gerichtet ist. Eine Lösung, die den primären Antikörper enthält, wird auf den Gewebeschnitt gegeben, und die Antikörper haben einige Zeit Zeit, um ihr Ziel zu finden und daran zu binden. Nach diesem Schritt werden ungebundene und überschüssige Antikörper abgewaschen, und der sekundäre Antikörper wird hinzugefügt. Der sekundäre Antikörper, der ein Linkermolekül mit Meerrettichperoxidase (HRP)-Enzymen trägt, hat ebenfalls einige Zeit Zeit, um an den primären Antikörper zu binden, gefolgt von einem weiteren Waschschritt. Danach wird 3,3′ Diaminobenzidin (DAB) zugegeben. Das HRP-Enzym wandelt das DAB-Substrat in ein bräunliches Präzipitat um, das sich an der Reaktionsstelle im Gewebe ablagert und so eine visuelle Darstellung der Stelle ergibt, an der der primäre Antikörper zuerst an sein Ziel gebunden hat.
Technologie
Gewebevorbereitung
Das Gewebe spielt eine zentrale Rolle im Experiment, und es ist wichtig, dass es so verarbeitet wird, dass Epitope und die richtige Morphologie erhalten bleiben. Für die IHC werden in der Regel formalinfixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Gewebeblöcke vorbereitet. Der Zweck der Formalinfixierung besteht darin, eine chemische Vernetzung der Proteine im Gewebe zu erreichen. Dadurch werden alle zellulären Prozesse beendet und die zellulären Bestandteile an dem Ort und in der Form eingefroren, in der sie sich zum Zeitpunkt der Fixierung befanden, und ein Abbau verhindert. Nach ausreichender Fixierung wird das Gewebe weiterverarbeitet und schließlich in Paraffinblöcke eingebettet, die dann mit einem Mikrotom in dünne Scheiben (in der Regel 4-10µm) geschnitten werden. Die Schnitte werden auf Objektträger aus Glas übertragen und vor der weiteren Bearbeitung zum Anhaften gebracht.
Neben Formalin werden manchmal auch andere Fixierungsmethoden verwendet. Dazu gehören andere Arten von Aldehyden oder die Verwendung verschiedener Alkohollösungen. Die Wahl des besten Fixierungsmittels hängt stark vom jeweiligen Test ab. Eine gängige Alternative zu FFPE ist die Herstellung gefrorener Gewebeproben. In diesem Fall wird das Gewebe in ein Kälteschutzmedium eingebettet und eingefroren, und die Fixierung wird nach der Sektion durchgeführt. Gefrorenes Gewebe wird in Kryostaten geschnitten und hat den Vorteil kurzer Verarbeitungszeiten und einer besseren Erhaltung empfindlicher Epitope, ist aber im Hinblick auf die Erhaltung der histologischen Morphologie oft schlechter als FFPE-Gewebe.
Antigen-(Epitop-)Retrieval
Ein Problem, das mit vernetzenden Fixierungsmitteln wie Formalin oder einer zu langen Verweildauer im Fixierungsmedium verbunden ist, ist die Maskierung von Epitopen, die den primären Antikörper an der Bindung an sein Ziel hindern kann. Vor allem bei FFPE-Proben ist es oft notwendig, einen Teil der chemischen Vernetzung rückgängig zu machen und die Epitope „zurückzuholen“, bevor man mit der eigentlichen IHC fortfährt. Es gibt mehrere Antigen-Retrieval-Protokolle, und die wichtigsten Strategien umfassen die Behandlung des Gewebeträgers mit Hitze, Verdauungsenzymen, Detergenzien oder Kombinationen davon. Die gebräuchlichste Methode zur Antigenrückgewinnung bei FFPE-Proben ist das Druckkochen der Gewebeschnitte in einem sauren Citratpuffer für etwa 15-20 Minuten.
Antikörperbindung
Die Qualität und Spezifität des Bindemoleküls ist für jede IHC-basierte Technik von entscheidender Bedeutung, und die Wahl des Bindemittels kann sich direkt auf das Ergebnis, die Zuverlässigkeit und möglicherweise auch auf die Interpretation des Assays auswirken. Antikörper sind die bei weitem häufigste Art von Bindemolekülen, die für die IHC verwendet werden. Obwohl die meisten Antikörper in der Lage sind, das richtige Molekül von Interesse zu erkennen, können sie sich auch in ihrer Spezifität für das beabsichtigte Ziel stark unterscheiden. Antikörper mit hoher Spezifität sind daher zuverlässiger bei der Interpretation der „On-Target“-Bindung, da sie wenig oder keine „Off-Target“-Bindung oder „Hintergrund“ erzeugen. Antikörper, die weniger spezifisch sind, können mehr Off-Target-Bindungen erzeugen, und der daraus resultierende Hintergrund stört möglicherweise die korrekte Interpretation der tatsächlichen On-Target-Signale. Es gibt zwei Haupttypen von Antikörpern: polyklonale Antikörper, d. h. eine heterogene Mischung von Antikörpern, die unterschiedliche Epitope auf dem Ziel binden, und monoklonale Antikörper, die alle dasselbe Epitop binden. Polyklonale Antikörper sind aufgrund ihrer Fähigkeit, mehrere Epitope auf demselben Ziel zu erkennen und zu binden, oft sehr wirksam. Die Epitope, die sie binden, sind jedoch oft schlecht definiert, und mit mehreren und unterschiedlichen Epitop-Spezifitäten steigt auch die Wahrscheinlichkeit von Off-Target-Bindungen und Hintergrundrauschen. Die Potenz polyklonaler Antikörper kann jedoch von Vorteil sein, da die Konzentration der Bindungsereignisse um das Zielmolekül in der Regel das potenzielle Hintergrundrauschen überwiegt. Ein Nachteil ist, dass polyklonale Antikörper in der Regel nur begrenzt verfügbar sind, da sie aus Tierseren gewonnen werden. Monoklonale Antikörper haben dagegen mehr Kontinuität, da sie in Hybridomazelllinien hergestellt werden können. Monoklonale Antikörper sind auch oft gut definiert in Bezug auf die Epitopbindung, können aber dennoch Ergebnisse liefern, die schwer zu interpretieren sind, wenn die Spezifität gering ist oder wenn das Zielepitop in geringer Menge vorhanden ist.
Die Antikörperkonzentration muss für jeden Test sorgfältig optimiert und titriert werden, da das Ergebnis nicht nur von der Spezifität und Affinität des Antikörpers für das Ziel abhängt, sondern auch von der Konzentration und Verfügbarkeit der in der Probe vorhandenen On-Target- und potenziellen Off-Target-Epitope. Wird der Probe zu viel Antikörper zugesetzt, erhöht sich die Zahl möglicher Off-Target-Bindungsereignisse mit geringer Affinität, sobald die On-Target-Epitope mit Bindemitteln gesättigt sind. Durch Senkung der Antikörperkonzentration werden Off-Target-Bindungsereignisse seltener, da sie in der Regel eine geringere Affinität haben als On-Target-Bindungsereignisse. Das Risiko bei dem Versuch, den Hintergrund zu reduzieren, während ein Antikörper mit niedriger Affinität verwendet wird, besteht darin, dass die On-Target-Signale gleichzeitig so weit abgeschwächt werden, dass sie ein falsch negatives Ergebnis liefern.
Andere Arten von Bindemolekülen, die manchmal in IHC-basierten Techniken verwendet werden, sind Affibodies, Peptide, Antikörperfragmente oder andere kleine Moleküle.
Detektionssysteme
Der ganze Zweck der Durchführung von IHC ist es, eine visuelle Darstellung davon zu erhalten, wo das Zielmolekül innerhalb des experimentellen Gewebes zu finden ist, und vorzugsweise auch Informationen über das Expressionsmuster des Zielmoleküls in heterogenen Zellpopulationen und/oder subzellulären Lokalisierungen zu erhalten. Dies wird in Abbildung 2 veranschaulicht, die zeigt, wie verschiedene Antikörper verwendet werden, um verschiedene zelluläre oder Gewebekompartimente innerhalb eines komplexen Gewebes sichtbar zu machen. Um die Ziel-Antikörper-Interaktion sichtbar zu machen, ist eine Art Nachweissystem erforderlich, das eine beobachtbare Färbung oder ein Signal erzeugt. Die gängigste Methode zur Einführung eines Nachweissystems in das Experiment ist die Verwendung eines sekundären Antikörpers, der ein vorgebundenes Reportermolekül, d. h. ein Enzym oder ein Fluorophor, trägt. Die sekundären Antikörper sind in der Regel speziell auf Antikörpermoleküle einer anderen Tierart ausgerichtet. Wenn beispielsweise der primäre Antikörper in einem Kaninchen gezüchtet wird, muss der sekundäre Antikörper in einem anderen Tier gezüchtet werden und spezifisch auf Kaninchenantikörper ausgerichtet sein.
| Ösophagus | Vergrößerung | ||
|---|---|---|---|
| Hematoxylin-Färbung | Keine Antikörperfärbung | ||
| TP63 CAB000083 |
Kernfärbung | ||
| EGFR CAB000035 |
Membranöse Färbung | ||
| G6PD HPA000247 |
Zytoplasmische Färbung | ||
| LAMB2 (Laminin) CAB000053 |
Bindegewebe |
Abbildung 2. Visualisierung verschiedener Proteinziele in komplexen Geweben. Die rechte Spalte zeigt eine Vergrößerung der entsprechenden Bilder in der linken Spalte.
Im IHC-Bild (Abbildung 2) ermöglichen aufeinanderfolgende Schnitte der menschlichen Speiseröhre, die mit vier verschiedenen Antikörpern angefärbt wurden, einen direkten Vergleich der verschiedenen Proteinexpressionsmuster im Gewebe und in den subzellulären Kompartimenten. Die oberen Bilder sind zum Vergleich nur mit Hämatoxylin gegengefärbt. Der p63-Antikörper färbt Zellkerne in einer Zellpopulation an, die sich im basalen Teil des Ösophagusepithels befindet. Der EGFR-Antikörper (Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors) scheint dieselbe Zellpopulation wie p63 zu färben, färbt aber Zellmembranen statt Zellkerne. Der G6PD-Antikörper (Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase) färbt das Zytoplasma eines breiteren Repertoires von Ösophagus-Epithelzellen und auch Zellen im Bindegewebe an. Der Antikörper gegen Laminin (LAMB2) färbt nur Zellen und Strukturen im Bindegewebe, das der Speiseröhre zugrunde liegt.
Bei FFPE-Gewebeproben besteht die gebräuchlichste Nachweismethode in der Verwendung enzymatischer Reaktionen zur Erzeugung eines farbigen Präzipitats an der Stelle der Antikörperbindung. Die sekundären Antikörper tragen dann ein Enzym, z. B. Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP), das in der Lage ist, Chromogene wie 3,3′ Diaminobenzidin (DAB) oder 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/ p-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (BCIP/NBT) in braune oder bläuliche Präzipitate umzuwandeln, die sich im Gewebe am Ort der Reaktion ablagern. Chromogene Färbungen sind in der Lichtmikroskopie beobachtbar und in der Regel über lange Zeiträume sehr stabil, was von Vorteil ist, wenn das Experiment archiviert oder zu einem späteren Zeitpunkt überprüft werden muss.
Für gefrorene Gewebeschnitte ist es üblicher, mit Fluorophoren verknüpfte sekundäre Antikörper zu verwenden, die bei Anregung durch die richtigen Lichtwellenlängen eine bestimmte Farbe (in der Regel grün, rot oder blau) abgeben. Außerdem sind Fluorophore in der Regel nicht über lange Zeiträume stabil. Der Vorteil der Verwendung von Fluorophoren besteht jedoch darin, dass sie eine einfache Methode zur Durchführung von Doppelmarkierungsexperimenten bieten, bei denen mehrere Antikörper gegen mehrere Ziele in derselben Probe getestet werden. Die sekundären Antikörper müssen gegen verschiedene primäre Antikörper gerichtet und an verschiedene Fluorophore gekoppelt sein. Die verschiedenen sekundären Antikörper werden dann separat beobachtet, indem sie nacheinander mit verschiedenen Lichtwellenlängen angeregt werden. Diese unterschiedlichen Anregungsergebnisse werden als getrennte Bilder (oder Farbkanäle) gespeichert und können später überlagert werden, um Rückschlüsse auf Protein-Kolokalisationen usw. zu ziehen.
Die Verwendung von Reporter-tragenden sekundären Antikörpern zum Nachweis ist an sich schon ein Verstärkungsschritt, da mehrere sekundäre Antikörper einen einzigen primären Antikörper binden können, aber manchmal sind weitere Verstärkungsschritte gewünscht, um das Signal und die Empfindlichkeit des Experiments zu erhöhen. In solchen Fällen kann der sekundäre Antikörper stattdessen „Linker-Moleküle“ tragen, z. B. Biotin-Polymere, die in der Lage sind, eine größere Anzahl von Reportermolekülen in nachfolgenden Schritten zu rekrutieren. Diese Strategie der Signalverstärkung ist sowohl für enzymatische als auch für fluoreszierende Nachweismethoden nützlich.
Gegenfärbung
Die immunhistochemische Färbung mit Chromogenen profitiert oft von der Anwendung einer Gegenfärbung, die den Kontrast verstärkt und die Beobachtung histologischer Merkmale erleichtert. Die am häufigsten verwendete Gegenfärbung für FFPE-Proben ist Hämatoxylin, das das zelluläre Zytoplasma mit einer hellen bläulichen Farbe und die Zellkerne mit einer dunkleren bläulichen Nuance färbt. Fluoreszenzfärbungen werden in der Regel nicht mit Hämatoxylin gegengefärbt, da die Nachweismethode nicht auf der Lichtmikroskopie basiert. Stattdessen werden Zellkerne meist durch Zugabe von Nukleinsäure bindenden Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um eine Gegenfärbung für die Fluoreszenz zu erhalten. Nach der eigentlichen immunhistochemischen Reaktion sind die einzigen verbleibenden Schritte das Eindecken und Versiegeln der Probe zum Schutz und zur langfristigen Lagerung. Am häufigsten wird das Deckglas mit handelsüblichen, speziell angefertigten Harzen auf die Probe „geklebt“.
Spezifische Beispiele
IHC wird sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Praxis häufig eingesetzt. Das Human Protein Atlas (HPA)-Projekt ist ein hervorragendes Beispiel dafür, wie die Hochdurchsatz-IHC zur groß angelegten Kartierung des menschlichen Proteoms in einer Vielzahl von Geweben, Krebsarten und Zellen eingesetzt wird. Im Rahmen des HPA-Projekts erleichtert eine rationalisierte interne Produktionskette für Antikörper in großem Maßstab die Herstellung spezifischer Antikörper, die nach Durchlaufen grundlegender Charakterisierungs- und Validierungsverfahren zur systematischen Färbung von Gewebe-Mikroarrays mit Hunderten von Gewebekernen in einem einzigen Experiment verwendet werden. Das von HPA eingesetzte IHC-System beruht in hohem Maße auf der Standardisierung von Protokollen und der Automatisierung durch Maschinen, aber die Bewertung der optimalen Titration für jeden Antikörper wird manuell durchgeführt, bevor der Antikörper für die Färbung des gesamten Gewebesatzes zugelassen wird. Jeder gefärbte Gewebekern wird im Hinblick auf die immunhistochemische Färbung von Geweben und Zelltypen kommentiert und anschließend als hochauflösendes Bild auf dem Webportal veröffentlicht, das von jedermann frei eingesehen werden kann.
In der klinischen Praxis wird die IHC hauptsächlich in der Pathologie eingesetzt, um Ärzte bei der Beurteilung von Gewebeproben im Hinblick auf den gesunden oder kranken Zustand zu unterstützen, Diagnosen zu stellen und den molekularen Subtyp verschiedener Krebsarten zu bestimmen. Ein spezifisches Beispiel für den diagnostischen Einsatz von IHC ist, wenn Pathologen eine metastatische Tumorprobe vorgelegt wird und der Ursprung des Primärtumors unbekannt ist. In diesen Fällen verwenden die Pathologen eine Reihe verschiedener Antikörper, die auf gewebespezifische Proteine abzielen, z. B. prostataspezifisches Antigen bei Prostatakrebs, Östrogenrezeptor bei gynäkologischen Krebsarten oder Zytokeratin 20 bei gastrointestinalen Krebsarten (Gremel et al., 2014). Sobald eine umfassende Klassifizierung vorgenommen wurde, werden zusätzliche gewebespezifische Antikörper verwendet, um den Ursprung des Primärtumors genauer zu bestimmen. Diese Informationen sind nützlich für die Wahl der besten oder geeignetsten Strategie für die medikamentöse Therapie und/oder für die Lokalisierung des Primärtumors für die Strahlentherapie und/oder Operation.
Referenzen und Links
Gemeinsam verwendete Antikörper für die Krebsdiagnostik:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopathology. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
Eine Übersicht über die Validierung von Antikörpern für IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – Eine frei zugängliche Datenbank mit öffentlich verfügbaren Antikörpern und deren Nutzen für verschiedene Anwendungen:
IHC world – Protokolle, Forum, Produkte und mehr:
Ein YouTube-Clip zur Veranschaulichung von IHC von BioGenexLaboratories: