00:00:07.25Hallo, mein Name ist Jennifer Doudna von der UC Berkeley
00:00:09.26und ich bin heute hier, um Ihnen zu erzählen, wie wir
00:00:12.26eine neue Genomtechnik entdeckt haben.
00:00:15.07Diese Geschichte beginnt mit dem bakteriellen Immunsystem
00:00:20.12Das bedeutet zu verstehen, wie Bakterien
00:00:22.14eine Virusinfektion abwehren.
00:00:24.26Es stellt sich heraus, dass viele Bakterien
00:00:28.04in ihrem Chromosom,
00:00:30.09was Sie hier sehen
00:00:32.15eine Sequenz von Wiederholungen haben, die in diesen schwarzen Rauten dargestellt sind
00:00:36.18die mit Sequenzen
00:00:40.19. die von Viren stammen
00:00:43.08 und die von Mikrobiologen
00:00:46.20 bemerkt wurden, die bakterielle Genome sequenzierten, aber niemand wusste
00:00:50.10, welche Funktion diese Sequenzen haben könnten
00:00:53.06bis man feststellte, dass sie auch
00:00:58.09 mit einer Reihe von Genen vorkommen, die oft für Proteine
00:01:03.29kodieren, die eine Homologie zu Enzymen haben, die interessante Dinge tun
00:01:09.03wie DNA-Reparatur.
00:01:10.12 Es war also eine Hypothese, dass dieses System
00:01:14.04, das später CRISPR
00:01:16.08 genannt wurde, was ein Akronym für diese Art von sich wiederholenden Loci ist
00:01:19.14, dass diese CRISPR-Systeme tatsächlich
00:01:22.29ein erworbenes Immunsystem in Bakterien
00:01:26.00sein könnten, das es ermöglicht, Sequenzen von Viren zu integrieren
00:01:29.06und dann später irgendwie
00:01:32.07zum Schutz der Zelle vor einer Infektion
00:01:35.26mit demselben Virus zu schützen.
00:01:37.05Das war also eine interessante Hypothese
00:01:39.11und wir haben uns Mitte der 2000er Jahre an der Untersuchung dieser
00:01:41.18 direkt nach der Veröffentlichung
00:01:44.15von drei Veröffentlichungen, die auf
00:01:47.13den Einbau von viralen Sequenzen
00:01:50.00in diese genomischen Loci hinwiesen.
00:01:52.07Und was sich in den nächsten Jahren herausstellte
00:01:55.17war, dass diese CRISPR-Systeme
00:01:58.08 tatsächlich erworbene Immunsysteme in Bakterien
00:02:01.18 sind. Bis zu diesem Zeitpunkt wusste also niemand, dass Bakterien
00:02:04.24 tatsächlich eine Möglichkeit haben könnten, sich
00:02:08.08an Viren anzupassen, die in die Zelle gelangen
00:02:10.29aber dies ist ein Weg, wie sie es tun
00:02:12.14und es beinhaltet die Erkennung von fremder DNA
00:02:15.17die wie in diesem Beispiel
00:02:18.04von einem Virus injiziert wird, das in die Zelle gelangt
00:02:20.07das CRISPR-System ermöglicht die Integration
00:02:26.06von kurzen Stücken dieser viralen DNA-Moleküle
00:02:29.15in den CRISPR-Locus
00:02:31.07und dann im zweiten Schritt
00:02:33.27die hier als CRISPR-RNA-Biogenese
00:02:38.20Diese CRISPR-Sequenzen werden tatsächlich
00:02:42.20in der Zelle in RNA-Stücke
00:02:45.15umgeschrieben, die dann zusammen
00:02:48.23mit den von den CAS-Genen kodierten Proteinen verwendet werden
00:02:52.09diese CRISPR-assoziierten Gene
00:02:54.01sind in der Lage, Stör- oder Interferenzkomplexe
00:02:58.12zu bilden, die die Information in Form
00:03:01.17dieser RNA-Moleküle nutzen können, um Basenpaare
00:03:04.08mit passenden Sequenzen in der viralen DNA zu bilden.
00:03:07.18Eine sehr raffinierte Methode also, die sich Bakterien
00:03:10.12ausgedacht haben, um ihre Eindringlinge
00:03:13.06zu übernehmen und die Sequenzinformationen gegen sie zu wenden.
00:03:17.00In meinem eigenen Labor
00:03:20.21 sind wir seit langem
00:03:23.09 sehr daran interessiert zu verstehen, wie RNA-Moleküle
00:03:26.03 verwendet werden, um Zellen dabei zu helfen, herauszufinden
00:03:32.00wie sie die Expression von Proteinen
00:03:34.
00:03:35.05Und so schien dies auch ein sehr interessantes
00:03:37.27Beispiel dafür zu sein, und
00:03:39.18wir begannen, die grundlegenden molekularen Mechanismen
00:03:42.24zu untersuchen, durch die dieser Weg funktioniert.
00:03:45.01Und 2011 ging ich zu einer wissenschaftlichen Konferenz
00:03:49.23und ich traf eine Kollegin von mir,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier, die auf diesem Bild
00:03:56.10ganz links zu sehen ist und Emmanuelles Labor
00:03:58.14 arbeitet an mikrobiologischen Problemen und sie sind
00:04:02.11besonders an Bakterien
00:04:04.00 interessiert, die menschliche Krankheitserreger sind.
00:04:06.01Sie untersuchte einen Organismus namens
00:04:08.03Streptococcus pyogenes, ein Bakterium
00:04:11.15, das beim Menschen sehr schwere Infektionen hervorrufen kann
00:04:14.25und das Merkwürdige an diesem Bazillus war, dass er
00:04:16.25ein CRISPR-System besitzt und in diesem Organismus
00:04:19.06 gab es ein einziges Gen, das für ein Protein
00:04:21.27kodierte, das als Cas9
00:04:23.12bekannt war und von dem genetisch nachgewiesen worden war, dass es
00:04:26.09für die Funktion des CRISPR-Systems
00:04:28.16in Streptococcus pyogenes erforderlich war,
00:04:30.23aber niemand wusste damals, welche Funktion
00:04:33.05dieses Protein hatte.
00:04:34.20Und so kamen wir zusammen und rekrutierten
00:04:37.20Menschen aus unseren jeweiligen Forschungslabors
00:04:40.26um die Funktion von Cas9 zu testen.
00:04:43.17Die Schlüsselfiguren des Projekts
00:04:45.20sind hier auf dem Foto zu sehen
00:04:48.00in der Mitte ist Martin Jinek
00:04:50.03der ein Postdoktorand in meinem eigenen Labor ist
00:04:52.17und neben ihm im blauen Hemd
00:04:54.22ist Kryztof Chylinski, der ein Student
00:04:57.20in Emmanuelles Labor war
00:04:58.26und so sind diese beiden Jungs zusammen mit
00:05:00.21Ines Fonfara, die ganz rechts steht,
00:05:02.10einem Postdoc mit Emmanuelle
00:05:04.01begannen Experimente auf der anderen Seite des Atlantiks
00:05:07.25und tauschten ihre Daten aus.
00:05:10.09Und sie fanden heraus, dass
00:05:13.06Cas9 tatsächlich ein faszinierendes Protein ist
00:05:16.04das die Fähigkeit hat, mit der DNA
00:05:19.28zu interagieren und einen Doppelstrangbruch
00:05:22.02in der DNA an Sequenzen zu erzeugen, die mit
00:05:25.06der Sequenz in einer Leit-RNA
00:05:27.08und auf diesem Dia sehen Sie
00:05:29.06die Leit-RNA
00:05:30.10und die Sequenz der Leit-RNA in orange
00:05:32.11an Basenpaaren mit einem Strang
00:05:34.18der doppelhelicalen DNA
00:05:37.11und, was sehr wichtig ist, diese RNA
00:05:39.28 interagiert mit einem zweiten RNA-Molekül
00:05:42.09, genannt tracr, das eine Struktur
00:05:46.03 bildet, die das Cas9-Protein
00:05:47.29 rekrutiert, so dass diese beiden RNAs und ein einziges Protein
00:05:50.13 sind in der Natur erforderlich
00:05:52.23, damit dieses Protein die
00:05:56.05 normalerweise virale DNA
00:05:58.11 in der Zelle erkennen kann, und das Protein
00:06:01.13 ist in der Lage, diese zu zerschneiden,
00:06:02.14wörtlich, indem es die Doppelhelix-DNA aufbricht.
00:06:05.24Und als wir das herausfanden
00:06:08.14dachten wir: wäre es nicht erstaunlich
00:06:10.26wenn wir tatsächlich ein einfacheres System
00:06:13.29wie es die Natur getan hat
00:06:15.02, indem wir diese beiden RNA-Moleküle
00:06:18.04 miteinander verbinden, um ein System zu erzeugen, das aus einem einzigen Protein
00:06:20.16 und einer einzigen leitenden RNA bestehen würde.
00:06:22.28Die Idee war also, diese beiden RNAs, die Sie auf der anderen Seite
00:06:29.29des Dias sehen, zu nehmen und sie im Grunde miteinander zu verbinden
00:06:33.19 , um etwas zu schaffen, das wir
00:06:35.04eine einzelne Leit-RNA nennen.
00:06:36.22 Martin Jinek im Labor
00:06:38.25 stellte dieses Konstrukt her
00:06:40.21und wir machten ein sehr einfaches Experiment
00:06:44.22um zu testen, ob wir wirklich
00:06:46.18ein programmierbares DNA-spaltendes Enzym
00:06:49.29und die Idee war, kurze einzelne guide RNAs
00:06:54.04 zu erzeugen, die verschiedene Stellen in einem zirkulären DNA-Molekül
00:06:59.24 erkennen, das Sie hier sehen
00:07:00.21und die guide RNAs wurden so entworfen
00:07:03.10, um die Sequenzen zu erkennen, die durch die roten Balken
00:07:06.17 auf der Folie dargestellt sind, und das Experiment bestand dann darin
00:07:10.16, dieses Plasmid, dieses zirkuläre DNA-Molekül
00:07:13.21 zu nehmen und es mit zwei verschiedenen Restriktions- (oder Schneid-) Enzymen zu inkubieren,
00:07:18.27eines namens SalI, das
00:07:21.23die DNA stromaufwärts am Ende
00:07:25.05der DNA in diesem Bild
00:07:26.12im grauen Kasten schneidet,
00:07:27.19und die zweite Stelle, die
00:07:31.00durch das RNA-gesteuerte Cas9
00:07:33.13an diesen verschiedenen Stellen, die in rot dargestellt sind.
00:07:35.16Und ein sehr einfaches Experiment
00:07:37.19wir haben diese Inkubationsreaktion
00:07:39.26mit Plasmid-DNA durchgeführt, und das ist das Ergebnis
00:07:43.24und das, was Sie hier sehen
00:07:45.28ist ein Agarosegel
00:07:47.29das uns erlaubt,
00:07:49.16die gespaltenen DNA-Moleküle zu trennen
00:07:51.20und Sie können sehen, dass wir in jeder dieser Reaktionsspuren
00:07:54.22ein DNA-Molekül unterschiedlicher Größe erhalten, das
00:07:58.12aus diesem doppelt verdauten Plasmid freigesetzt wird
00:08:00.16wobei die Größe der DNA
00:08:03.29der Spaltung an den verschiedenen Stellen
00:08:06.11entspricht, die durch diese rot
00:08:08.26angezeigten Leit-RNA-Sequenzen
00:08:10.24angezeigt werden. Das war also ein wirklich aufregender Moment
00:08:12.29ein eigentlich sehr einfaches Experiment, das
00:08:15.15 wie ein „A ha!“-Moment
00:08:17.03 als wir sagten, dass wir wirklich ein programmierbares DNA-Schneideenzym haben
00:08:22.02 und dass wir es mit einem kurzen Stück RNA
00:08:24.15 programmieren können, um im Wesentlichen jede doppelsträngige DNA-Sequenz zu schneiden
00:08:28.07Der Grund, warum wir so aufgeregt waren
00:08:30.23über ein Enzym, das programmiert werden kann
00:08:33.19um doppelsträngige DNA-Brüche
00:08:36.01an jeder beliebigen Sequenz zu erzeugen, ist, weil
00:08:39.00Es gab eine lange Reihe von Experimenten
00:08:42.16in der wissenschaftlichen Gemeinschaft, die zeigten
00:08:45.13dass Zellen Wege haben, doppelsträngige DNA-Brüche
00:08:49.26zu reparieren, die zu Veränderungen
00:08:52.02in der genomischen Information in der DNA
00:08:55.21Dies ist also eine Folie, die zeigt, dass
00:08:58.20nachdem ein Doppelstrangbruch erzeugt wurde
00:09:01.14durch jede Art von Enzym, das dies tun könnte
00:09:04.13einschließlich des Cas9-Systems
00:09:06.05Diese Doppelstrangbrüche in einer Zelle
00:09:09.07werden erkannt und durch zwei Arten von Wegen repariert
00:09:13.15einer auf der linken Seite, der die
00:09:17.26nicht-homologe Endverbindung
00:09:20.07bei der die Enden der DNA chemisch miteinander ligiert
00:09:24.07werden, normalerweise mit Einführung
00:09:26.18einer kleinen Insertion oder Deletion
00:09:28.25an der Stelle des Bruchs
00:09:29.27und auf der rechten Seite
00:09:32.01ist eine andere Art der Reparatur
00:09:34.00durch homologiegeleitete Reparatur
00:09:37.22, bei der ein Spender-DNA-Molekül
00:09:39.14mit Sequenzen, die mit denen
00:09:43.28, die die Stelle des
00:09:45.12Doppelstrangbruchs flankieren, in das Genom an der Stelle
00:09:50.10des Bruchs integriert werden kann, um neue genetische Information
00:09:54.06in das Genom einzuführen
00:09:55.15Dies brachte viele Wissenschaftler
00:09:59.04auf die Idee, dass, wenn es ein Werkzeug
00:10:01.04oder eine Technologie gäbe, die es
00:10:03.05Wissenschaftlern oder Forschern erlauben würde,
00:10:06.12doppelsträngige Brüche an bestimmten Stellen
00:10:09.00in der DNA einer Zelle einzuführen, dann kennen wir zusammen
00:10:12.12mit all den Genomsequenzierungsdaten
00:10:14.21, die jetzt verfügbar sind, die
00:10:16.10gesamte genetische Sequenz einer Zelle
00:10:18.21 Und wenn man wüsste, wo eine Mutation aufgetreten ist
00:10:21.20, die zum Beispiel eine Krankheit verursacht
00:10:23.20, könnte man eine Technologie wie diese
00:10:26.25 verwenden, um DNA einzuführen, die eine Mutation behebt
00:10:31.00oder eine Mutation
00:10:32.23 zu erzeugen, die Sie in einer Forschungsumgebung untersuchen möchten
00:10:35.04Die Stärke dieser Technologie ist also
00:10:38.28die Idee, dass wir jetzt
00:10:41.20diese Arten von Doppelstrangbrüchen
00:10:43.17an Stellen, die wir als Wissenschaftler
00:10:46.17auswählen, indem wir Cas9 programmieren und dann
00:10:48.13der Zelle erlauben, Reparaturen durchzuführen, die
00:10:51.04genomische Veränderungen an den Stellen dieser Brüche einführen
00:10:54.15Die Herausforderung war jedoch, wie man die Brüche
00:10:58.11 überhaupt erzeugen konnte, und so wurden in verschiedenen Labors
00:11:00.09verschiedene Strategien entwickelt
00:11:03.24, um dies zu erreichen
00:11:05.15Die meisten von ihnen, und ich werde hier
00:11:08.21zwei spezifische Beispiele zeigen
00:11:10.17eine davon nennt sich Zinkfinger-Nukleasen
00:11:12.25und die andere TAL-Effektor-Domänen
00:11:15.02beides sind programmierbare Wege
00:11:18.08, um Doppelstrangbrüche in der DNA zu erzeugen
00:11:20.21, die auf der proteinbasierten Erkennung
00:11:23.29 von DNA-Sequenzen beruhen, also sind dies Proteine
00:11:26.06, die modular sind und in verschiedenen Kombinationen
00:11:29.12in verschiedenen Kombinationen von Modulen
00:11:31.22um verschiedene DNA-Sequenzen zu erkennen
00:11:34.03es funktioniert als Technologie
00:11:37.18aber es erfordert eine Menge Protein-Engineering
00:11:40.24um dies zu tun, und was wirklich aufregend
00:11:43.16an diesem CRISPR/Cas9-Enzym
00:11:46.11ist, dass es ein RNA-programmiertes Protein ist
00:11:49.25so dass ein einziges Protein für
00:11:52.09jede Stelle der DNA verwendet werden kann, an der wir
00:11:54.27einen Bruch erzeugen möchten
00:11:56.13durch einfaches Ändern der Sequenz
00:11:58.16der mit Cas9 assoziierten Leit-RNA
00:12:00.24anstatt uns also auf die proteinbasierte Erkennung
00:12:03.06der DNA zu verlassen, verlassen wir uns auf
00:12:06.04RNA-basierte Erkennung der DNA
00:12:08.26 Wie unten gezeigt, bedeutet das
00:12:11.03, dass es sich um ein System handelt
00:12:12.18, das einfach genug ist, um es zu benutzen
00:12:15.15, so dass jeder mit einer molekularbiologischen Grundausbildung
00:12:19.05dieses System
00:12:20.29nutzen kann, um Genome Engineering
00:12:22.20zu betreiben, und so ist dies ein Werkzeug, das wirklich
00:12:26.06Ich denke, dass es eine wesentliche
00:12:29.03und bisher fehlende Komponente
00:12:30.24 dessen, was wir den IT-Werkzeugkasten der Biologie nennen könnten
00:12:33.29, der nicht nur die Fähigkeit
00:12:36.00 umfasst, die DNA zu sequenzieren und ihre Struktur zu betrachten, sondern auch die Doppelhelix, die wir seit den 1950er Jahren
00:12:39.24 kennen.00und in den letzten Jahrzehnten
00:12:44.18konnte man Enzyme
00:12:46.09wie Restriktionsenzyme
00:12:47.26und die Polymerase-Kettenreaktion
00:12:49.09zur Isolierung und Amplifikation bestimmter Abschnitte
00:12:52.19 der DNA zu isolieren und zu amplifizieren, und jetzt haben wir mit Cas9
00:12:55.10 eine Technologie, die
00:12:57.15facile genome engineering
00:12:59.13 ermöglicht und Laboren auf der ganzen Welt zur Verfügung steht
00:13:03.07für Experimente, die sie vielleicht durchführen wollen
00:13:05.08und dies ist also eine Zusammenfassung der Technologie
00:13:10.11des 2-Komponenten-Systems
00:13:11.29es beruht auf RNA-DNA-Basenparing
00:13:14.16für die Erkennung
00:13:15.21und, was sehr wichtig ist, aufgrund der Art und Weise
00:13:18.24dieses System funktioniert
00:13:19.28ist es eigentlich ziemlich einfach
00:13:21.18etwas zu tun, was man Multiplexing
00:13:24.20 nennt, was bedeutet, dass wir Cas9
00:13:27.00mit mehreren verschiedenen Leit-RNAs
00:13:28.23in derselben Zelle programmieren, um
00:13:30.19mehrere Brüche zu erzeugen und Dinge zu tun
00:13:32.06wie große Abschnitte eines Chromosoms herauszuschneiden
00:13:35.01und sie einfach in einem Experiment zu löschen.
00:13:38.25Und das hat zu einer echten Explosion
00:13:42.03 auf dem Gebiet der Biologie und Genetik
00:13:45.19mit vielen Labors auf der ganzen Welt
00:13:48.08die diese Technologie
00:13:49.25für alle möglichen sehr interessanten
00:13:51.15und kreativen Anwendungen
00:13:53.13 und das ist eine Folie
00:13:54.24, die eigentlich schon fast veraltet ist
00:13:56.11 aber um Ihnen einen Eindruck
00:13:57.14 davon zu geben, wie sich das Feld
00:14:00.07 wirklich entwickelt hat
00:14:01.08 also haben wir unsere ursprüngliche Arbeit über Cas9
00:14:04.10im Jahr 2012 und bis zu diesem Zeitpunkt
00:14:07.16 gab es nur sehr wenig Forschung
00:14:08.18 auf dem Gebiet der CRISPR-Biologie
00:14:11.12es war ein sehr kleines Feld
00:14:12.19und dann kann man sehen, dass
00:14:13.27seit 2013 und seither
00:14:16.09 gibt es diese
00:14:17.21unglaubliche Explosion an Veröffentlichungen
00:14:20.16von Laboren, die diese Technologie
00:14:22.09als Genom-Engineering-Technologie
00:14:24.01 Es war also wirklich sehr aufregend für mich
00:14:26.25 als Grundlagenwissenschaftler zu sehen, wie sich das, was
00:14:29.22als Grundlagenforschungsprojekt
00:14:31.12begann, in eine Technologie verwandelte, die sich
00:14:34.08als sehr hilfreich für alle möglichen
00:14:35.28von aufregenden Experimenten
00:14:37.07und ich wollte zum Schluss noch ein paar Dinge
00:14:40.07mit Ihnen teilen,
00:14:42.17die mit dieser Technologie gemacht werden
00:14:44.17also natürlich auf der linken Seite
00:14:47.13 viel Grundlagenbiologie, die jetzt
00:14:50.02mit der Entwicklung von Modellorganismen
00:14:53.03und verschiedenen Arten von Zelllinien
00:14:55.02die im Labor gezüchtet werden
00:14:56.21um das Verhalten von Zellen zu untersuchen
00:14:58.13 aber auch in der Biotechnologie, wo man in der Lage ist
00:15:01.23 gezielte Veränderungen in Pflanzen
00:15:05.15 und verschiedenen Arten von Pilzen vorzunehmen, die sehr
00:15:07.11 nützlich für verschiedene industrielle Anwendungen sein könnten
00:15:09.29 und dann natürlich in der Biomedizin
00:15:12.14mit viel Interesse an dem Potential
00:15:14.14, diese Technologie als Werkzeug
00:15:17.03für die Entwicklung neuer Therapien
00:15:21.06für menschliche Krankheiten zu nutzen, denke ich, ist etwas
00:15:23.09, das sehr aufregend ist und wirklich etwas
00:15:26.05 ist, das sich bereits am Horizont abzeichnet
00:15:27.09, und dann zeigt diese Folie wirklich an
00:15:30.20, wohin sich das meiner Meinung nach entwickeln wird
00:15:33.15in der Zukunft mit vielen interessanten
00:15:36.20und kreativen Richtungen
00:15:39.03die sich in verschiedenen Labors
00:15:41.02sowohl in akademischen Forschungslabors
00:15:43.19aber auch zunehmend in kommerziellen Labors
00:15:45.29, die den Einsatz dieser
00:15:49.24Technologie für alle möglichen Anwendungen
00:15:52.18 ermöglichen werden, von denen wir uns viele vor zwei Jahren noch nicht einmal vorstellen konnten.
00:15:54.10So aufregend, und ich möchte nur einem großartigen Team
00:16:01.10von Leuten, die mit mir an dem Projekt gearbeitet haben, und wir hatten
00:16:06.07eine großartige finanzielle Unterstützung von verschiedenen Gruppen
00:16:11.00und es war mir ein Vergnügen
00:16:13.00dies mit Ihnen zu teilen, danke schön.