dNTP steht für Desoxyribose-Nukleotidtriphosphat, das in der PCR verwendet wird, um den wachsenden DNA-Strang zu erweitern. dATP, dTTP, dGTP und dTTP sind vier übliche dNTPs, die in der PCR verwendet werden.
Die Funktion von dNTPs in der PCR ist es, den wachsenden DNA-Strang mit Hilfe der Taq-DNA-Polymerase zu erweitern. Es verbindet sich mit dem komplementären DNA-Strang durch Wasserstoffbrückenbindungen.
Die PCR ist eine in vitro-Technik der DNA-Synthese. Der Zweck der Durchführung der PCR ist es, mehrere Kopien von DNA-Fragmenten unseres Interesses zu erzeugen, um sie in der Gelelektrophorese sichtbar zu machen.
Das Ziel der PCR ist die Herstellung von Millionen von DNA-Kopien für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen wie DNA-Sequenzierung oder DNA-Mikroarray.
Die Polymerase-Kettenreaktion ist das unübertroffene Werkzeug, das seit ihrer Entdeckung in der molekulargenetischen Forschung eingesetzt wird. DNA-Vorlage, Primer, Puffer, Taq-DNA-Polymerase und dNTPs sind die Bestandteile der PCR. Um den Mechanismus der PCR zu verstehen, müssen wir die Bedeutung jedes einzelnen Bestandteils kennenlernen.
In diesem Artikel werden wir einen der wichtigsten Bestandteile der PCR besprechen, nämlich die dNTPs. Wir werden auch auf ihre Struktur eingehen und warum sie so wichtig sind.
Weiterhin werden wir auch über den Mechanismus der Interaktion von dNTPs und Taq-DNA-Polymerase und ihre Wirkung auf den wachsenden DNA-Strang sprechen.
Weiterhin werden wir über den Mechanismus sprechen, wie dNTPs und DNA-Polymerase interagieren und dabei helfen, den DNA-Strang wachsen zu lassen.
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Schlüsselthemen:
Was sind dNTPs?
Die dNTPs sind die künstlichen Nukleotide, die in der PCR verwendet werden, um neue DNA-Stränge zu synthetisieren, ähnlich wie bei der DNA-Replikation. dATP, dTTP, dGTP, dTTP sind übliche Nukleotide, die in der PCR-Mastermischung vorhanden sind.
Struktur von dNTPs:
Das dNTP steht für Desoxyribose-Nukleotid-Triphosphat.
Zum Verständnis der dNTPs müssen wir zunächst einige Grundbegriffe wie Base, Nukleotide, Nukleoside, Ribonukleotide, Desoxyribonukleotide, Dideoxyribonukleotide verstehen. Dies sind einige grundlegende Begriffe, die routinemäßig in der Genetik verwendet werden, dennoch haben die Leute sie falsch verstanden.
Adenin und Guanin sind Purinbasen, Cytosin und Thymin sind Pyrimidinbasen. Stickstoffhaltige Basen können die DNA nicht direkt bilden. Ein Phosphatgerüst und ein Pentosezucker sind zusätzlich erforderlich, um ein DNA-Molekül zu bilden.
Das Nukleotid besteht aus einem Pentosezucker, einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen Base. Ein Nukleotid verbindet sich mit einem anderen benachbarten Nukleotid über eine Phosphodiesterbindung, während ein Nukleotid sich mit einem anderen Nukleotid auf dem gegenüberliegenden DNA-Strang über Wasserstoffbrückenbindungen verbindet.
Das Bild zeigt die Struktur von Desoxyribose-Triphosphat, -Diphosphat und -Monophosphat.
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Das im Nukleotid vorhandene Phosphat ist Triphosphat (Tri-Drei), wenn Phosphat nicht mit dem Nukleotid verbunden ist (oder fehlt), wird es als Nukleosid bezeichnet (Nukleotid ohne Phosphat wird als Nukleosid bezeichnet).
Wenn ein Wasserstoffatom die Hydroxylgruppe im Pentosezucker ersetzt, wird der Zucker als Desoxyzucker bezeichnet. Die DNA besteht aus Desoxy-Pentosezucker, während die RNA nur aus Ribosezucker besteht.
Die dNTPs sind eine Kette von Nukleotiden, die aus Ribose, Stickstoffbase und Phosphat besteht.
Die ddNTPs unterscheiden sich von den dNTPs.
Dideoxynukleotidtriphosphat hat keine freie 3′-OH-Gruppe, eine andere 3′-OH-Gruppe des Zuckers ist durch Wasserstoff ersetzt.
Deshalb kann es die Ausdehnung eines wachsenden DNA-Strangs nicht bewirken. Daher werden diese Arten von ddATP, ddTTP, ddCTP und ddGTP bei der DNA-Sequenzierung verwendet. Wir werden die Rolle der ddNTPs bei der Sequenzierung in einem anderen Artikel ausführlich besprechen.
Die ddNTPs werden bei der Methode des Kettenabbruchs verwendet, um die Ausdehnung der DNA-Synthese zu stoppen.
Das Bild stellt den Unterschied zwischen Ribosezucker, Desoxyribosezucker und Desoxyribosezucker dar.
Das Triphosphat besteht aus drei verschiedenen Phosphatmolekülen, die der DNA ein Rückgrat verleihen.
Das Phosphatgerüst der DNA besteht aus drei verschiedenen Phosphatmolekülen, dem Alpha-, Beta- und Gamma-Phosphat. Wenn ein Phosphat oder Gamma-Phosphat freigesetzt wird, nennt man die Struktur Desoxynukleotid-Diphosphat.
Wenn zwei der drei Phosphate freigesetzt werden, nennt man die Struktur Desoxynukleotid-Monophosphat.
dATP und dGTP sind Purine, dCTP und dTTP sind pyrimidine dNTPs, die in der PCR-Reaktion verwendet werden. Die Funktion der dNTPs in der PCR ist die gleiche wie bei der Replikation in vivo. Wenn Sie sich für die Unterschiede zwischen Nukleotiden und Nukleosiden und Purinen und Pyrimidinen interessieren, lesen Sie diese Artikel:
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Das Bild zeigt vier verschiedene dNTPs Struktur.
Die Funktion von dNTPs:
Die dNTPs sind die Bestandteile von PCR, RT-PCR, DNA-Sequenzierung oder DNA-Mikroarray, die zum Wachstum der DNA oder zur Amplifikation der DNA beitragen.
Wirkmechanismus:
Der Prozess der PCR ist in drei temperaturabhängige Schritte unterteilt:
- Denaturierung
- Annealing
- Extension.
Im Denaturierungsschritt wird die doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA denaturiert; im Annealing-Schritt bindet der Primer genau an der Stelle, an der seine komplementäre Sequenz vorhanden ist, und,
im Extensionsschritt fügt die Taq-DNA-Polymerase die dNTPs an den wachsenden DNA-Strang an.
Wenn der Strang geöffnet ist und der Primer an die einzelsträngige DNA bindet, beginnt die Taq-DNA-Polymerase ihre katalytische Aktivität.
Die Taq-DNA-Polymerase verwendet die einzelsträngige DNA als Substrat für die enzymatische Aktivität und setzt sich an der Primer-DNA-Verbindung fest.
Das eine Ende der Taq-DNA-Polymerase bindet in der Nähe der 3′-OH-Gruppe des Oligonukleotid-Primers, dieser Komplex wird als P-DNA-Komplex bezeichnet.
Das Bild zeigt die Struktur der DNA mit Wasserstoffbrücken und der Phosphodiesterbindung der DNA.
Im nächsten Schritt beginnt die dNTP-Addition.
Das dNTP bindet mit schwacher Affinität an den P-DNA-Komplex, wenn das exakte komplementäre Nukleotid vorhanden ist. Bald darauf hält die Taq-DNA-Polymerase es fest und es kommt zur Wasserstoffbrückenbindungs-Wechselwirkung zwischen einer komplementären Base und dem dNTP.
Hier entscheidet zunächst nicht das gesamte Nukleotid, sondern die am dNTP vorhandene Base (Stickstoffbase), ob es bindet oder nicht.
Erstens, wenn es die komplementäre Base auf der ssDNA-Vorlage findet (A für T und G für C), bildet es die Wasserstoffbrücken zwischen ihnen. Es werden drei Wasserstoffbrücken zwischen C und G und zwei Wasserstoffbrücken zwischen A und T hergestellt.
Wenn sich die Wasserstoffbrücken gebildet haben, verbindet die Taq-DNA-Polymerase das dNTP mit dem wachsenden DNA-Strang, indem sie eine Phosphodiesterbindung bildet. Nach der Bildung der Phosphodiesterbindung geht die Taq-DNA-Polymerase nun einen Schritt weiter, um neues dNTP hinzuzufügen.
Die Phosphodiesterbindung wird zwischen dem 3′ OH des Primers und dem 5′ P des dNTPs gebildet.
Nach der Bildung der Wasserstoffbrückenbindung katalysiert die Taq-DNA-Polymerase die Reaktion, indem sie das Gamma- und Beta-Phosphat aus dem Triphosphat des dNTP entfernt. Nach Abschluss der Reaktion werden zwei Pyrophosphate (PPi) freigesetzt.
Die genaue Kinetik, wie die dNTPs und die Taq-Polymerase während der PCR-Reaktion zusammenwirken, ist noch nicht bekannt.
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Die Konzentration von dNTPs in der PCR:
Im Allgemeinen sind für eine PCR-Reaktion mit 30 bis 35 Zyklen eines Laufs 200μM jedes dNTPs ausreichend.
Jeweils 200μM, was bedeutet, dass in einer einzigen PCR-Reaktion insgesamt 800μM von 4 dNTPs-Mischungen verwendet werden. Wir müssen unsere Arbeitskonzentration aus der Stammlösung von 100mM herstellen.
In den letzten Tagen sind jedoch gebrauchsfertige Mastermixe sehr beliebt und effektiv. Die gebrauchsfertige Mastermischung enthält alle wichtigen Bestandteile wie dNTPs-Mischung, Gelladefarbstoff und Taq-DNA-Polymerase.
Als Student der Naturwissenschaften müssen wir uns fragen, wie wir die Arbeitslösung aus dem Vorrat herstellen können. Angenommen, wir müssen 2mM Arbeitslösung aus 100mM Stammlösung herstellen.
Nun,
Erinnern Sie sich an V1C1= V2C2?
Hier ist die gegebene Konzentration C1 100mM (das ist die Bestandskonzentration von dNTPs)
V1 ist das gegebene Volumen ist unbekannt (?)
C2 ist die erforderliche Konzentration = 2mM
V2 ist das erforderliche Volumen= 1000μL
Nun ist V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Hier, 20μL jedes dNTPs für die Herstellung der Arbeitslösung benötigt, so dass das Endvolumen für unsere Mischung 80μL (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) in 920μL D/W beträgt.
Damit ergibt sich eine Endkonzentration von 2mM jedes dNTP in 1000μL Arbeitslösung. Berechnen Sie selbst 200μM.
Mein ultimativer Leitfaden für die Verwendung von dNTPs in der PCR
Bereiten Sie immer zwei Röhrchen mit Stammlösungen vor und lagern Sie alle Röhrchen bei -20°C.
Berechnen Sie, wie viele Reaktionen Sie in einer Woche durchführen und stellen Sie dementsprechend die Arbeitslösung aus der Stammlösung her und lagern Sie sie bei 4°C. Denn wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermindert die Aktivität der dNTPs.
Tragen Sie bei der Herstellung der Arbeitslösung immer eine Schutzbrille und achten Sie auf sterile Bedingungen, denn eine Kontamination mit Fremd-DNA behindert die PCR-Reaktion.
Die 200μM-Konzentration ist für die PCR-Reaktion ausreichend, für die Langstrecken-PCR können jedoch 2mM bis 3 mM Konzentration jedes dNTPs verwendet werden.
Mit zunehmender dNTP-Konzentration steigt die Rate der unspezifischen Bindung. Ebenso führt die Knappheit von dNTPs zu unvollständigen PCR-Produkten. Verwenden Sie also immer eine angemessene Menge an dNTPs.
Fazit:
Schließlich ist die Funktion der dNTPs in der PCR-Reaktion genauso wichtig wie die der Taq-DNA-Polymerase.
Mit Hilfe der Taq binden die dNTPs an den wachsenden DNA-Strang und dehnen ihn aus. Wenn du dich nicht mit all diesen Dingen herumschlagen willst, kannst du ein fertiges PCR-Kit verwenden, das besser geeignet ist. Allerdings musst du die manuelle Methode der Reagenzienvorbereitung lernen.