Abstract
Mit den zunehmend verbesserten Möglichkeiten zur Trennung komplexer Proben und zum Nachweis unbekannter Stoffe ist die Flüssigchromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (LC-MS) in der Forschung zur traditionellen chinesischen Medizin (TCM) weit verbreitet. Dieser Artikel beschreibt die Prinzipien der Flüssigchromatographie (LC) und der Massenspektrometrie (MS) sowie deren Vor- und Nachteile bei der qualitativen und quantitativen Analyse von TCM. Wir haben Forschungsliteratur über die Anwendung von LC-MS in der TCM recherchiert, die in den letzten fünf Jahren im In- und Ausland veröffentlicht wurde. Um die Analyse von TCM besser zu leiten, konzentriert sich diese Übersicht hauptsächlich auf die Anwendungskategorie von LC-MS, wie oft verschiedene Arten von LC-MS verwendet werden, und die qualitativen und quantitativen Fähigkeiten der verschiedenen LC-MS in der Studie von TCM.
1. Einleitung
Die jahrtausendelange Erfahrung unserer Vorfahren mit Leben und Krankheit wurde schließlich in eine moderne Apotheke umgesetzt. Chinesische Kräuter mit ihren komplexen und vielfältigen Inhaltsstoffen werden in der Regel nach den Regeln des Monarchen, des Ministers, des Assistenten und des Führers auf Rezept angewendet. Bei der Anwendung kann die Menge der einzelnen Kräuter und pharmazeutischen Formulierungen variieren, was zu Veränderungen in der Wechselwirkung zwischen den Arzneimitteln und dem Wirkstoff führen kann. In verschiedenen Anwendungsgebieten von Arzneimitteln gibt es Unterschiede bei den Inhaltsstoffen. Aufgrund der Komplexität der chemischen Zusammensetzung der TCM können verschiedene chemische Zusammensetzungen auch miteinander reagieren. Obwohl die praktische Anwendung die Wirksamkeit der TCM bewiesen hat, ist es immer noch schwierig, die spezifischen Arzneimittelwirkstoffe der TCM in der modernen Wissenschaft zu erklären. In den letzten Jahren sind der In-vivo-Stoffwechsel und der Wirkmechanismus eines Wirkstoffs zu einem wichtigen Forschungsthema der chinesischen Medizin geworden. Aber ihre Eigenschaften, wie die komplexe Zusammensetzung, der Mechanismus der Multitarget- und Multimode-Wirkung und die Rolle der Inhaltsstoffe, erschweren die Erforschung der TCM in gewissem Maße.
LC-MS integriert in vollem Umfang die hohe Trennkapazität der Probe von LC für komplexe Proben und die starke qualitative Fähigkeit von MS . Aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und Selektivität ist die LC-MS-Technik in der TCM-Forschung weit verbreitet.
2. LC
Die Chromatographie trennt das Gemisch anhand der Unterschiede des Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden Phasen (mobile und stationäre Phase). Je nach Beschaffenheit der mobilen Phase kann die Chromatographie in Gaschromatographie, Flüssigkeitschromatographie und überkritische Flüssigkeitschromatographie unterteilt werden, während die Chromatographie nach den geometrischen Formen der stationären Phase in Säulenchromatographie, Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie unterteilt werden kann. Die am häufigsten verwendete LC-Methode ist die Säulenchromatographie, bei der eine Flüssigkeit als mobile Phase verwendet wird. Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde auf der Grundlage der klassischen Säulenchromatographie für Flüssigkeiten modifiziert.
Die Anwendung der LC wird in zwei Kategorien unterteilt. Eine davon ist qualitativ oder quantitativ für eine bestimmte Zusammensetzung. Die Qualifizierung erfolgt nach der Übereinstimmung zwischen der Probe und der Zielkomponente in der Peakzeit. Die Quantifizierung erfolgt anhand der Standardkurve, die nach der Injektion von Standards in verschiedenen Konzentrationsstufen erstellt wird. Die andere ist ein Fingerabdruck, der sich auf die Vorstellung bezieht, dass wir, nachdem die Fingerabdruckprobe in irgendeiner Weise entsorgt wurde, ein Chromatogramm oder ein Spektrogramm erhalten können, das mit chemischen Merkmalen gekennzeichnet ist, indem wir bestimmte Analysemethoden verwenden.
LC hat einen großen Vorteil bei der Fähigkeit, komplexe Proben zu trennen, so dass es die effektivste Option ist, wenn es zur Trennung von Gemischen angewendet wird, aber nicht geeignet ist, um strukturelle Informationen des Materials zu erhalten. Die Qualifizierung durch den Kontrast zwischen den Peak-Positionen unbekannter Verbindungen und den Standards ist für die Überwachung unbekannter Verbindungen nicht verfügbar.
3. MS
Die Massenspektrometrie ist im Bereich der TCM-Forschung aufgrund ihrer hohen Selektivität, hohen Empfindlichkeit und der Fähigkeit, Informationen einschließlich der relativen Molekülmasse und struktureller Merkmale zu liefern, weit verbreitet. Die MS vervollständigt die Qualifizierung anhand der Molekülmasse und der relevanten Strukturinformationen und vervollständigt die Quantifizierung anhand der Beziehungen zwischen dem Peak und dem Gehalt der Verbindung, die der Peak darstellt. Die Atmosphärendruck-Ionisierung (API) der MS verfügt über Elektrospray-Ionisierung (ESI) und chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck (APCI). ESI hat für viele Arten von Verbindungen eine hohe Empfindlichkeit. Im Vergleich zur ESI ist die APCI für weniger polare Verbindungen und die Analyse flüchtiger Verbindungen geeignet. Je nach den Unterschieden zwischen den verwendeten Massenanalysatoren schließen die gängigen MS auf Quadrupol-Massenspektrum (Q-MS), Flugzeit-Massenspektrum (TOF-MS) und Ionenfallen-Massenspektrometrie (IT-MS).
Tandem-Massenspektrometrie bezieht sich auf zwei oder mehr MS, die zusammen arbeiten. Die am häufigsten verwendete Tandem-Massenspektrometrie ist die Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (QQQ-MS). Um Quadrupole für die mehrstufige Massenspektrometrie zu verwenden, werden drei Quadrupole hintereinander geschaltet, was als Triple-Quadrupol bezeichnet wird. Eine andere Art der Tandem-Massenspektrometrie, wie die Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (Q-TOF-MS) und die Quadrupol-Ionenfallen-Tandem-Massenspektrometrie (Q-IT-MS), besteht ebenfalls aus einer Reihe von Qualitätsanalysatoren. Ionenfalle Zeitreihe kann mehrstufige MS-Scans sequentiell zu verschiedenen Zeiten zu erreichen, so dass diese Studie kategorisiert IT-MS als Tandem-Massenspektrometer.
Die Tandem-Massenspektrometrie kann Fragmente von Molekül-Ionen erzeugen, die von der MS der ersten Stufe erzeugt werden, woraus wir die Beziehung zwischen Kind und Elternteil ableiten können, strukturelle Informationen des Moleküls erhalten und dann die Struktur der Verbindung vorschlagen und die Qualitätsanalyse für bekannte und unbekannte Verbindungen genauer durchführen können.
Obwohl die MS strukturelle Informationen über ein Material liefern kann, erfordert sie eine höhere Reinheit der Probe. In der TCM-Forschung wird sie in der Regel in Kombination mit LC eingesetzt.
4. LC-MS
Die LC-MS-Technik, bei der LC als Trennsystem und MS als Nachweissystem verwendet wird, liefert schließlich das Spektrum. Wenn LC und MS zusammenarbeiten, können sie eine mehrstufige MS durchführen, um die Struktur der Verbindung zu spekulieren und so die qualitative und quantitative Analyse genauer abzuschließen.
Bei der Durchsicht der in den letzten fünf Jahren im In- und Ausland veröffentlichten Arbeiten über LC-MS in der TCM-Forschungsliteratur haben wir festgestellt, dass sie in zwei Kategorien unterteilt werden können, nämlich LC-Q-MS und LC-MS/MS. Um die Unterschiede sowie die Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden zu analysieren, wurden die Arbeiten nach dem Unterschied der Tandem-Massenspektrometrie klassifiziert.
4.1. LC-Q-MS
LC-Q-MS kann zur Durchführung qualitativer und quantitativer Analysen für Standardkomponenten verwendet werden, wie in Tabelle 1 dargestellt. Bei der qualitativen Analyse können wir strukturelle Informationen durch Scannen von positiven oder negativen Ionen erhalten. Durch den Vergleich mit der Standardliteratur lässt sich auch feststellen, zu welcher Art von Stoff die chemische Struktur gehört. Das LC-Q-MS quantifiziert Verbindungen durch die Auswahl spezifischer Ionen für die Überwachung. In Ermangelung von Standards, kann LC-Q-MS die qualitative Analyse für die Substanz mit starken qualitativen Eigenschaften der Massenspektrometrie durchführen .
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LC-Q-MS kann Substanzen qualitativ analysieren, aber einige Isomere oder Substanzen mit identischem Molekulargewicht müssen weiter erforscht werden, deren Strukturen mit Hilfe der mehrstufigen Massenspektrometrie weiter identifiziert werden müssen. Außerdem führt eine ungenaue Qualifizierung zu einer Verzerrung der Quantifizierung.
4.2. LC-MS/MS
4.2.1. LC-IT-MS
IT-MS erfasst verschiedene Qualitätsbereiche von Ionen, indem es verschiedene Größen der an die Ringelektroden angelegten HF-Spannung verwendet. Es hat eine hohe Empfindlichkeit, und ein einziges IT-MS kann mehrstufige Massenspektrometrie-Funktionen erfüllen.
IT-MS kann Zeitserien von mehrstufigen MS-Scans in verschiedenen zeitlichen Reihenfolgen realisieren und bietet eine MSn-Fragmentierung als Bestandteil; daher ist es für qualitative Fragen geeignet und liefert strukturelle Informationen für die Identifizierung unbekannter Zusammensetzungen, wie in Tabelle 2 gezeigt. Bei der Untersuchung von TCM wird LC-IT-MS üblicherweise für die qualitative Zusammensetzung verwendet.
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4.2.2. LC-QQQ-MS
Dreifach-Quadrupol bedeutet, dass drei Quadrupole geordnet angeordnet sind. Jeder Quadrupol hat eine eigene Funktion. Zu den Scan-Modi des Dreifach-Quadrupols gehören der Full-Scan-Modus, der Produkt-Ionen-Scan-Modus, der Eltern-Ionen-Scan-Modus, der Neutralisationsverlust-Scan-Modus, der ausgewählte Ionen-Scan-Modus und der Mehrfachreaktions-Überwachungs-Scan-Modus.
LC-QQQ-MS wird hauptsächlich zur Quantifizierung verwendet, wie in Tabelle 3 dargestellt. Einige Studien werden für die Qualifizierung verwendet. Im Vergleich zu LC-Q-MS kann LC-QQQ-MS bestimmte Ionen zur Kollision auswählen und die Fragmente nach der Kollision analysieren. LC-QQQ-MS kann das Mutterion und das Tochterion gleichzeitig nachweisen und ist daher genau, empfindlich und umfassend. LC-QQQ-MS kann in einem breiteren Bereich eingesetzt werden. Im Vergleich zu anderen Tandem-Massenspektrometern bietet das Dreifach-Quadrupol-System die beste quantitative Reproduzierbarkeit. LC-QQQ-MS ist die bekannteste quantitative Substanzmethode.
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4.2.3. LC-Q-TOF-MS
LC-Q-TOF-MS wird im Allgemeinen für die Qualitätsbestimmung verwendet. Sie hat eine höhere Nachweisempfindlichkeit und Massenauflösung. LC-Q-TOF-MS kann die Masse genau messen.
LC-Q-TOF-MS wird hauptsächlich für die qualitative Analyse von Materialien verwendet, wie in Tabelle 4 gezeigt. Im Vergleich zu verschiedenen anderen Tandem-Massenspektrometern hat es Vorteile bei der Nachweisempfindlichkeit, der Massengenauigkeit und der Auflösung. Die hohe Auflösung und Massengenauigkeit verleihen dem LC-Q-TOF-MS eine bessere qualitative Fähigkeit für Fragment-Ionen. Es ist auch überzeugender bei der Unterscheidung von Ionenstruktur und Isomeren neben dem Parsing unbekannter Strukturen in dieser Methode .
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5. Schlussfolgerungen
Im Vergleich zu LC-MS und LC-MS/MS wird die Forschung mit LC-MS/MS relativ häufiger durchgeführt, was eine höhere Genauigkeit bei der qualitativen Analyse von bekannten und unbekannten Verbindungen ermöglicht. LC-IT-MS hat aufgrund seiner Fähigkeit, mehrere Ebenen der Massenspektrometrie zu nutzen, eine bessere Leistung bei der Bewertung einer unbekannten Zusammensetzung. LC-Q-IT-MS hat eine bessere Auflösungsqualität als LC-IT-MS. Im Vergleich zu den anderen drei Arten von LC-MS/MS wurde festgestellt, dass LC-QQQ-MS häufiger für Forschungszwecke eingesetzt wird und eine bessere quantitative Fähigkeit besitzt als andere. Seine qualitativen Fähigkeiten sind gut, aber noch nicht so gut wie LC-Q-TOF-MS. LC-Q-TOF-MS wird hauptsächlich für die qualitative Analyse von Stoffen verwendet. Einige seiner Fähigkeiten sind relativ hervorragend, wie z. B. die Nachweisempfindlichkeit, die Massengenauigkeit und die Auflösung.
Die qualitativen Methoden unterscheiden sich von den verschiedenen LC-MS-Methoden, während die quantitativen Methoden im Grunde gleich sind, da alle quantitativen Methoden Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen erfordern. Quantitative Methoden werden in der Regel in zwei verschiedene Arten unterteilt: die externe Standardmethode und die interne Standardmethode. Externe Standardmethode bedeutet, dass zur Durchführung der quantitativen Analyse zunächst eine Standardkurve erstellt wird, deren horizontale Achse die Konzentrationen und die vertikale Achse die Fläche des Farbspektrums darstellt. Anhand der Peakfläche kann dann eine qualitative Analyse durchgeführt werden. Interne Standardmethode bedeutet, dass zunächst der interne Standard mit bekannter Konzentration zu den Lösungen der Probe und der hybriden Referenzsubstanz hinzugefügt wird; dann wird eine Standardkurve erstellt, deren horizontale Achse das Verhältnis der Konzentration der Referenzprobe zur Konzentration der internen Standardprobe darstellt und deren vertikale Achse das Verhältnis der Peakfläche des Standards zur Peakfläche des internen Standards darstellt. Zum Schluss wird die interne Standardprobe injiziert. Anhand der Peakfläche der Testindikatoren und des internen Standards kann eine qualitative Analyse durchgeführt werden.
In der TCM-Forschung wurde festgestellt, dass LC-Q-TOF-MS die bessere Wahl für die qualitative Analyse ist, während LC-QQQ-MS sich für die quantitative Analyse als besser erweist. Bei der quantitativen Analyse wird ein bestimmter Standard mit einer bestimmten Konzentration verwendet. Bei der qualitativen Analyse kann die Struktur einiger unbekannter Inhaltsstoffe gemessen werden, und es kann anhand der Informationen aus der vorhandenen Forschungsliteratur und der Datenbank über ihre Zugehörigkeit spekuliert werden. Die Standardvalidierung ist für qualitatives Material am genauesten. Aufgrund der komplexen Zusammensetzung und der unbekannten Fähigkeiten der TCM können die Forschungsmethoden dem Bedarf noch nicht gerecht werden. Weitere Forschung und Erkundung sind noch notwendig.
Konkurrierende Interessen
Alle Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81273925) unterstützt.