Zwischen 1512 und 1516 schufen die Künstler Niclaus von Haguenau (für den skulpturalen Teil) und Grünewald (für die gemalten Tafeln) dieses berühmte Altarbild für die Klosteranlage des Antoniterordens in Isenheim, einem Dorf etwa 15 Meilen südlich von Colmar. Das Polyptychon, das bis zur Französischen Revolution den Hochaltar der Kapelle des Klosterspitals schmückte, wurde von Guy Guers in Auftrag gegeben, der von 1490 bis 1516 als Präzeptor der Einrichtung diente.
Das um 1300 gegründete Kloster Isenheim gehörte zum Orden des Heiligen Antonius, der im 11. Die Mönche des Antoniterordens kümmerten sich um die Opfer des Antoniusfeuers, einer schrecklichen Krankheit, die im Mittelalter weit verbreitet war. Heute weiß man, dass die Ursache dieses Unglücks eine Vergiftung durch einen Pilz (Mutterkorn) ist, der auf Roggengras wächst und das für die Brotherstellung verwendete Roggenmehl verunreinigt. Mutterkorn enthält eine chemische Substanz, die die Opfer in den Wahnsinn treibt und aufgrund der Verengung der Blutzufuhr zu den Extremitäten zu Wundbrand an Händen und Füßen führt. Um die Kranken zu versorgen, servierten die Antoniter ihnen gutes Brot und ließen sie ein Gebräu trinken, das sie „Saint Vinage“ nannten, einen heiligen, gestärkten Wein, in dem die Mönche zunächst eine spezielle Kräutermischung eingeweicht und dann die Reliquien des Heiligen Antonius eingeweicht hatten. Sie stellten auch eine Salbe aus Kräutern her, die entzündungshemmende Eigenschaften besaßen.
Nach und nach erwarben die Mönche von Isenheim eine reiche Sammlung von Kunstwerken, die vom Kloster in Auftrag gegeben und finanziert wurden, darunter auch dieses Altarbild. Es befand sich bis zur Revolution in dieser religiösen Einrichtung und wurde 1792 zur Aufbewahrung an die örtliche Zweigstelle der französischen Nationalbibliothek übergeben. 1852 wurde es in die Kapelle des ehemaligen Dominikanerklosters Unterlinden in Colmar gebracht, wo es zum wichtigsten Schatz des damals gegründeten Museums wurde und seither die Besucher immer wieder in seinen Bann zieht.